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研究背景与目的：淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径,也足判断患者预后的首要因素。随着对血管内皮生长因子C(VEGF-C)研究的深入,其诱导肿瘤淋巴管生成及促进肿瘤淋巴道转移已成为不争的事实[1]。我们前期研究表明[2],VEGF-C在乳腺癌组织中呈高表达,与乳腺癌细胞增殖及肿瘤间质淋巴管生成、淋巴结转移等密切相关。因此,若能有效阻断乳腺癌中VEGF-C的表达,将可望通过抑制肿瘤细胞增殖及间质淋巴管的生成,抑制乳腺癌生长和转移。
RNA干扰(RNAi)作为一种新型实用的分子生物学技术发展非常迅速,其发现为人们提供了特异性阻断基因表达的新策略。RNAi在不影响细胞正常基因功能的前提下,使肿瘤相关基因沉默,从而达到基因治疗的目的；同时siRNA具有双链结构,比单链结构的反义寡核苷酸更能抵御核酶的降解,因此更具有成为治疗药物的潜力[3]。
基于以上背景,本研究拟构建靶向VEGF-C基因的RNAi真核表达载体,转染乳腺癌MCF-7细胞并观察其对VEGF-C表达及乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响,探讨以VEGF-C为靶点的RNAi技术在乳腺癌基因治疗中的应用前景。
方法：
一、设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组质粒pSIREN-VEGF-C;Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ双酶切、生物DNA测序进行鉴定。
二、脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C及阴性对照质粒pSIREN-NC转染乳腺癌MCF-7细胞株；嘌呤酶素筛选阳性克隆。
三、荧光定量PCR及Westen-blot检测重组质粒pSIREN-VEGF-C对乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达的影响。
四、MTT法检测重组质粒pSIREN-VEGF-C对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。
五、Transwell体外侵袭实验检测重组质粒pSIREN-VEGF-C对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的影响。
六、RT-PCR检测转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中MMP-2、9 mRNA表达情况。
结果：
一、重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致；测序显示序列完全正确。
二、1μg/mL嘌呤霉素筛选10天左右,挑选单克隆,逐步扩大培养成稳定表达VEGF-C shRNA细胞株MCF-7/V-C。
三、荧光定量PCR及Westen-blot检测结果表明,转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95％及100％,与空白对照组相比有显著差异(p＜0.05);而阴性对照组与空白对照组相比无差异(p＞0.05)。
四、MTT结果显示,重组质粒组各时相的吸光值均较空白对照组的吸光值有明显降低(p＜0.05),而阴性质粒组与空白对照组之间的吸光值无差异(p＞0.05);细胞生长曲线也表明,重组质粒组的细胞增殖明显受抑制。
五、Transwell体外侵袭实验表明,重组质粒组穿过滤膜的细胞数明显减少(p＜0.05),而阴性质粒组与空白对照之间相比无差异(p＞0.05)。
六、RT-PCR检测结果显示,重组质粒组的MMP-2、9 mRNA表达明显受抑制,抑制率分别为55％、75％,与空白对照组相比有显著差异(p＜0.05);而阴性对照组与空白对照组相比无差异(p＞0.05)。
结论：
一、成功构建了表达VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C,并证明其在乳腺癌MCF-7细胞中能高效、特异地发挥靶基因沉默作用。
二、证实重组质粒pSIREN-VEGF-C对乳腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭能力有显著抑制作用,为RNAi技术应用于乳腺癌靶向基因治疗提供了实验理论依据。