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目的;膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,在发达国家或地区发病率较高。国外,膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖系肿瘤中仅次于前列腺癌,居第2位;在国内则占首位,并且近年有增加的趋势。临床治疗膀胱癌一般是进行手术、放疗、化疗及免疫治疗,但疗效都不理想,病人预后较差。对转移性和晚期的膀胱癌,目前尚无十分有效的治疗方法,病人死亡率高。因此迫切需要寻找新的治疗方法。随着分子生物学技术的发展和肿瘤分子生物学研究的深入,基因治疗为肿瘤的综合治疗提供有益的借鉴与帮助。
核转录因子STAT3过度激活将导致细胞的异常增殖和凋亡障碍,促进肿瘤的形成、发展。在膀胱癌组织及其细胞系T24和5637中均有STAT3异常表达及过度活化。鉴于此,我们以T24和5637细胞为靶细胞、STAT3为靶点,研究核转录因子诱骗(transcriptionfactordecoy)技术对膀胱癌细胞生物学特征的影响,分析其干扰STAT3功能的作用机制,并通过体外实验初步评价运用诱骗寡核苷酸(DecoyODN)技术干扰STAT3通路作为膀胱癌治疗靶点的可行性。
主要方法:
1.WesternBlot技术检测总STAT3、酪氨酸磷酸化及丝氨酸磷酸化STAT3的表达水平。
2.应用阳离子聚合物梭华-Sofast介导的转染方法,流式细胞仪检测转染效率;以蓝色荧光染料DAPI染色,在倒置荧光显微镜下观察decoyODN在细胞内的分布。
3.凝胶迟滞电泳实验(EMSA)验证decoyODN的特异性:应用STAT3decoyODN和scrambleODN序列作为探针,提取T24和5637细胞的核蛋白进行EMSA实验,同时应用过量未标记探针进行冷竞争实验。
4.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入法检测STAT3decoyODN对T24和5637细胞增殖的抑制作用。
5.RT-PCR检测已知STAT3下游靶基因bcl-xL、cyclinD1和c-myc的mRNA水平的变化;
6.Westernblot检测bcl-xL和cyclinD1蛋白水平的变化;
7.用流式细胞仪检测其对T24和5637细胞周期的影响及bcl-2蛋白水平的变化;用Annexin-V和PI双染检测细胞凋亡。
结果:
(1)T24和5637细胞中STAT3及其活化形式酪氨酸磷酸化STAT3和丝氨酸磷酸化STAT3表达活跃;
(2)DecoyODN能高效转染T24及5637细胞,转染阳性率分别达76.8%、68.2%;STAT3decoyODN能特异性结合活化STAT3。
(3)MTT实验检测到DecoyODN对T24和5637细胞的生长呈浓度依赖性抑制,DecoyODN浓度为100nmol/L时,抑制效果最明显,抑制率在40%至48%之间;
(4)100nmol/L的DecoyODN转染T24和5637细胞18小时后,提取细胞总mRNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,证实bcl-xL、cyclinD1和c-myc的mRNA表达下调;
(5)转染T24和5637细胞24小时后,Western-blot检测到bcl-xL和cyclinD1蛋白表达下调;
(6)流式细胞术检测显示,T24细胞经decoyODN处理后,S期细胞比率下降,下降幅度为11%,G1期细胞比率增加,增加幅度为10%;流式细胞术还测到T24细胞bcl-2蛋白表达下调;
(7)Annexin-V/PI双染实验显示,decoyODN作用24h后,T24细胞系凋亡细胞增加。
以上各试验同时设同浓度scrambleODN组及空白细胞组作对照,发现scrambleODN组对膀胱癌细胞系的增殖及STAT3下游基因的表达无明显抑制作用,对细胞周期亦无明显影响。
结论:
在膀胱癌T24和5637细胞系中,异常活化的STAT3导致bcl-xL,bcl-2,cyclinDl和c-myc等基因表达异常,是导致细胞凋亡受阻、细胞周期进展异常的主要原因之一。本试验由阳离子聚合物梭华-sofast将STAT3decoyODN有效地转染入T24和5637细胞核内,与转录因子STAT3发生特异性结合,从而抑制STAT3靶基因bcl-xL,bcl-2,cyclinDl和c-myc等的表达,阻抑细胞周期进展,促进细胞凋亡,进而抑制T24和5637细胞的增殖。结果显示,运用decoyODN抑制STAT3通路作为膀胱癌治疗靶点理论上具有可行性。