论文部分内容阅读
目的:BRAFV600E是甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)最常见的突变基因,目前已常规用于FNA无法定性良恶性时的充分、必要辅助诊断指标。另有研究提示BRAFV600E可能是PTC患者颈部淋巴结转移的有力预测因子,但具体机制上不清楚。我们发现大多数研究仅仅通过“定性”诊断来预判淋巴结的转移,即“有、无”突变,但缺乏PTC患者BRAFV600E基因突变的定量研究,因此本课题拟使用超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound-targeted Microbubble Destruction,UTMD)联合RNA干扰技术,通过抑制PTC的BRAFV600E突变基因,从体内外探寻BRAFV600E突变程度与PTC发生颈部淋巴结转移的相关性及其发生机制。方法:(1)选取2016年-2017年在本院行甲状腺癌手术的患者,筛选出术前相关临床病理学和影像学资料较为完善的甲状腺乳头状癌患者280例,并以术后病理结果为金标准,根据有、无发生淋巴结转移进行分组,比较两组患者生活习惯、基本情况(年龄、性别等)、原发肿瘤的超声学特点、BRAFV600E突变情况的统计学差异;分别用突变试剂盒及免疫组化定量检测两组的BRAFV600E在 mRNA和蛋白表达水平上的差异;将上述定量结果从低到高进行等级分层,通过Logistic回归模型分析定量BRAFV600E与PTC患者发生颈部淋巴结转移风险的相关性。(2)载siRNABRAFV600E靶向脂质纳泡的制备:用旋转蒸发法联合碳二亚胺法制备靶向阳离子脂质纳泡,通过正负电荷吸引法连接纳泡与siRNA。用光学显微镜、透射电镜、共聚焦显微镜观察其形态,用马尔文仪器检测粒径及电位,荧光显微镜及流式细胞术检测体外寻靶能力以及携载siRNABRAFV600E能力。(3)体外实验:将PTC B-CPAP细胞分为四组,分别是靶向阳离子纳泡(FA-CNBs)组、阳离子纳泡(CNBs)组、中性纳泡(NNBs)组及PBS组,使用UTMD技术介导脂质微泡载siRNABRAFV600E靶向转染B-CPAP细胞,使用qPCR及Western Blot检测细胞的BRAFV600E、MEK、ERK、E-Cadherin及Snail的mRNA和蛋白表达水平;CCK8检测细胞的活性和毒性;流式细胞术检测细胞的周期和凋亡;同时检测转染后细胞的侵袭和迁移能力。(4)体内实验:构建裸鼠PTC B-CPAP细胞皮下移植瘤模型,分为靶向阳离子纳泡(FA-CNBs)组、阳离子纳泡(CNBs)组、中性纳泡(NNBs)组及PBS组。通过裸鼠尾静脉注射微泡,使用UTMD技术进行体内移植瘤基因靶向转染治疗,使用 qPCR、Western Blot 及免疫组化检测组织的 BRAFV600E、MEK、ERK、E-Cadherin及Snail的mRNA和蛋白表达水平;同时观察肿瘤的生长,TUNEL及EdU染色分别检测肿瘤细胞的凋亡和增殖情况,并计算肿瘤抑瘤率(%)。结果:(1)通过PCR和免疫组化分析,定量BRAFV600E在两组之间有统计学差异,淋巴结转移组的mRNA含量和免疫组化强度均高于非转移组;Logistic回归模型分析显示,随着BRAFV600E蛋白表达水平的不断提高,PTC患者发生颈部淋巴结转移的风险也不断增加。(2)三种不同类型的纳泡(FA-CNBs、CNBs和NNBs)表面光滑、形态均一、分布均匀,粒径大小分别为 471.36±23.34nm、469.32±29.18nm 和 480.35±22.15nm,(p>0.05);表面电荷分别为 35.1 8±3.2mV、32.34±4.18mV 和-3.25±0.38mV;三种纳泡中,靶向阳离子纳泡体外寻靶能力最强,并具良好的载基因能力。(3)在体外实验中,B-CPAP细胞在受靶向阳离子纳泡载siRNA转染后,其BRAF及下游的MEK/ERK表达水平受抑制最明显,E-Cadherin的表达水平较其余三组明显增加,同时Snail表达水平下降(p<0.05)。细胞的增殖、侵袭能力下降。(4)在体内移植瘤纳泡基因转染实验中,同样是靶向阳离子纳泡组(siRNA-FA-CNBs组)的皮下移植瘤受抑制最明显,抑瘤率分别为52.56±5.22%、23.69±4.11%、17±3.13%(p<0.05);siRNA-FA-CNBs 组的凋亡细胞最多,增殖程度也低于其余三组。结论:定量BRAFV600E在PTC患者颈部淋巴结预测方面是有价值的;我们构建的三种纳泡基因携载量和转染效率均不同,在转染BRAFV600E表达阳性的PTC肿瘤细胞后,降低了促PTC肿瘤细胞发生转移的相关分子表达,抑制了肿瘤细胞的增殖,增加了肿瘤细胞的凋亡,为BRAFV600E表达阳性、易发生淋巴结转移的患者提供了一个安全、有效的治疗方式。