【摘 要】
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糖尿病(DMs),是一种常见的具有遗传倾向的代谢性疾病,其中,II型糖尿病的特点是胰岛素抵抗、高胰岛素血症以及胰腺β-细胞的衰竭。由于α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,AG)和DPP-Ⅳ酶抑制剂可通过减缓机体对糖的吸收来控制血糖浓度,故在II型糖尿病的治疗方面有很广泛的应用。本论文以绵羊乳清蛋白作为原料,利用酶解的方法,获得具有AG抑制活性和DPP-Ⅳ酶抑制活性的多肽溶液,对所得到的多肽
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糖尿病(DMs),是一种常见的具有遗传倾向的代谢性疾病,其中,II型糖尿病的特点是胰岛素抵抗、高胰岛素血症以及胰腺β-细胞的衰竭。由于α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,AG)和DPP-Ⅳ酶抑制剂可通过减缓机体对糖的吸收来控制血糖浓度,故在II型糖尿病的治疗方面有很广泛的应用。本论文以绵羊乳清蛋白作为原料,利用酶解的方法,获得具有AG抑制活性和DPP-Ⅳ酶抑制活性的多肽溶液,对所得到的多肽进行分离、纯化和鉴定;利用分子对接软件,进行进一步筛选,并研究肽对靶酶的抑制机制。合成筛选得到的肽后,采用酶活法与细胞培养法对抑制肽进行体外活性验证,为II型糖尿病药品以及相关保健食品的开发提供新的思路和选择。研究以乳清蛋白粉为底物,进行水解,以水解度、水解物对AG和DPP-Ⅳ酶的体外抑制活性作为指标筛选反应条件。测定结果表明,胰蛋白酶水解4 h时,获得的水解物的水解度为24.50±0.05%,具有三种水解酶中最高的AG抑制率(21.71±0.50%),该酶的水解物也表现出最高的DPP-Ⅳ酶的抑制活性(77.80±1.87%)。试验选用胰蛋白酶处理后的绵羊乳清蛋白水解肽溶液进行DEAE-52离子交换层析分离。进一步进行梯度洗脱,选取具有两种酶抑制活性的组分均是H4,对AG的抑制活性最高(40.19±2.88%),对DPP-Ⅳ的抑制活性为24.66±2.31%。对水解物进行分子量分布测定,选择Sphadex G-15葡聚糖凝胶柱填料进行进一步分离,得到两个组分,组分H4-1、H4-2都具有AG抑制活性,H4-1的AG抑制率更高,为16.45±1.96%。组分H4-2的DPP-Ⅳ酶抑制率为20.36±3.10%,而H4-1组分没有显示出DPP-Ⅳ酶的抑制活性。对H4-1,H4-2组分进行质谱鉴定,H4-1、H4-2组分分别鉴定出60个、86个肽段。利用分子对接对肽进行初步筛选,得到AG抑制肽为RYEEDMYWR(RY9)、RMMNAMER(RM8),DPP-Ⅳ抑制肽为RLYLHENK(RL8)、MQEHFTCCR(MQ9)。RY9,RM8主要通过氢键、疏水相互作用与AG分子结合,RL8、MQ9主要通过氢键、疏水相互作用结合在DPP-Ⅳ分子的活性位置。并使用Caco-2细胞进行验证DPP-Ⅳ抑制活性。本实验为发现潜在的降糖食物以及降糖药物的研发来源提供了思路。
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