研究背景和目的鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的一种头颈部恶性肿瘤。目前普遍认为EB病毒、化学致癌物和遗传易感性是促使鼻咽癌发生发展的三大因素,但NPC的分子发病机制尚不完全清楚。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤,且其发生部位较为隐蔽,因此多数病人在确诊时都为中、晚期且常伴有转移,且治疗后五年生存率始终在60%以下,因此继续探索鼻咽癌发病的分子机制、寻找有价值的早期诊断生物标志物及治疗靶标仍具有重要意义。人Cripto-1（CR-1）,是表皮生长因子-CFC（epidermal growth factor-Cripto-1/FRL1/cryptic,EGF-CFC）家族成员,是一个由188个氨基酸组成的细胞外糖蛋白,为早期胚胎发生所必须。Cripto-1在体内有两种活性形式:一是通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）键锚定于细胞膜上作为复合受体;二是GPI键断裂后以可溶性分泌蛋白的形式作为生长因子样的配体。虽然Cripto-1是胚胎干细胞的一个标志,成体内通常不表达,但却过表达于75%-80%的乳腺癌、结肠癌、肺癌以及50%-60%的胃癌、胰腺癌、卵巢癌及睾丸癌。此外,Cripto-1的表达在诸如结肠腺瘤、胃的肠上皮化生及乳腺导管原位癌等癌前病变中亦显著提高。Caterina等2006年报道血浆Cripto-1水平可作为是早期发现结肠癌和乳腺癌的生物标志物。体外实验和转基因鼠研究均表明,Cripto-1通过促进细胞增殖、生存、迁移、侵袭和诱导细胞转化、上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）及肿瘤血管形成等在肿瘤发生发展中发挥瘤基因的重要作用。由于Cripto-1在肿瘤组织高表达,正常组织低表达甚至不表达,因此它也是恶性肿瘤治疗的新靶点。体内体外实验均证明,拮抗Cripto-1的反义寡核苷酸及中和性封闭Cripto-1的单克隆抗体能明显抑制结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌及白血病细胞的生长。尽管目前已证明Cripro-1与某些恶性肿瘤发生发展存在相关,而且也展现出作为新的早期诊断和分子生物治疗靶点的潜力。然而,Cripto-1与鼻咽癌的关系如何,迄今尚无相关报道。同时,Cripto-1为何在肿瘤中重新高表达,其始动因素尚不得而知。因此本课题旨在研究Cripto-1在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性;进一步通过改变Cripto-1的表达水平观察其对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响;最后利用荧光差异双向凝胶电泳的蛋白组学方法,初步探讨Cripto-1在鼻咽癌发病机制中所涉及的信号通路,从而为进一步理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断与分子靶向治疗靶点提供新线索。研究内容与方法1.鼻咽癌中Cripto-1表达特性的鉴定及临床意义采用免疫组化、Western blot、荧光定量RT-PCR及RT-PCR方法从蛋白和mRNA水平检测Cripto-1在临床鼻咽癌组织标本及鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、SUNE1、HNE1、HONE1和C666-1中的表达情况,并分析其与临床特征的联系,探讨Cripto-1与鼻咽癌发生发展及侵袭转移的关系。2.Cripto-1表达沉默对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响利用已知的Cripto-1干扰片段,构建含H1启动子和绿色荧光蛋白（greenfluorescent protein,GFP）的慢病毒载体,将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集病毒上清,进行病毒滴度测定。将含Cripto-1特异干扰片段的慢病毒感染CNE2细胞,以空载体的病毒为阴性对照,利用GFP的表达用流式细胞仪筛选出稳定的干扰株。荧光定量PCR法检测Cripto-1在干扰前后mRNA的变化;Western blot法检测干扰前后Cripto-1蛋白表达的情况;用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测Cripto-1沉默后对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响;利用体外侵袭实验（Boyden小室）检测Cripto-1沉默后对鼻咽癌细胞体外侵袭能力的影响。3.Cripto-1过表达对鼻咽癌细胞CNE1生物学特性的影响应用PCR、酶切及DNA测序鉴定Cripto-1真核表达载体pCI/CR-1。用其转染鼻咽癌细胞CNE1,以空载体pCI/neo为阴性对照,应用G418进行筛选获取Cripto-1稳定过表达的细胞克隆。荧光定量PCR法检测Cripto-1过表达前后mRNA的变化;Western blot法检测过表达前后Cripto-1蛋白表达的情况;用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测Cripto-1过表达后对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响;利用Boyden小室检测Cripto-1过表达后对鼻咽癌细胞体外侵袭能力的影响。4.人鼻咽癌细胞株CNE1/neo和CNE1/CR-1⁺的蛋白质组荧光差异双向凝胶电泳分析为了更好的理解Cripto-1在鼻咽癌细胞中的作用机理和寻找其所参与的信号通路,我们运用双向荧光凝胶内差异显示电泳（two-dimensional differential in-gelelectrophoresis,2D-DIGE）技术对稳定过表达Cripto-1的CNE1/CR-1⁺及阴性对照CNE1/neo细胞进行了差异表达蛋白质组分析。经图像软件分析,获得有统计学差异的蛋白质点,选择2倍以上的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定,并在mRNA水平对候选蛋白进行初步验证。结果1.鼻咽癌中Cripto-1表达特性的鉴定及临床意义（1）Cripto-1在鼻咽癌细胞中的表达采用Real-time RT-PCR检测Cripto-1基因在鼻咽癌细胞株及鼻咽永生化上皮细胞NP69中的表达情况,结果表明Cripto-1在鼻咽癌细胞株中的mRNA表达水平均显著高于鼻咽永生化上皮细胞NP69（P＜0.05）。SNK多重比较显示Cripto-1在CNE2细胞（ΔΔCt=-11.680±1.074）和C666-1（ΔΔCt=-10.637±0.637）细胞中表达最高,在CNE1细胞（ΔΔCt=-3.523±0.648）和HNE1细胞（ΔΔCt=-3.443±1.694）中表达最低,而HONE1（ΔΔCt=-6.150±1.536）和SUNE1（ΔΔCt=-6.447±0.396）细胞中的表达水平介于两者之间。单因素方差分析显示7种细胞株中Cripto-1的表达差异具有显著性（F=48.783,P＜0.001）。Western blot结果与荧光定量PCR结果一致。（2）RT-PCR检测Cripto-1在鼻咽癌组织中的表达共收集17例NPC、7例鼻咽慢性炎标本。在17例鼻咽癌组织中,13例Cripto-1呈阳性表达,阳性表达率为76.5%;7例慢性鼻咽炎中,仅有2例表达Cripto-1mRNA,阳性表达率为28.6%;两者表达水平的差异具有显著性（P=0.042）。（3）免疫组织化学检测Cripto-1蛋白在鼻咽癌组织中的表达SP免疫组化结果表明,Cripto-1表达主要定位在鼻咽癌细胞膜和细胞浆,而在慢性鼻咽炎组织及肿瘤周围相对正常组织、间质组织则为弱阳性或阴性表达。37例鼻咽癌组织中,Cripto-1蛋白阳性表达的有20例,而20例慢性鼻咽炎组织中则有4例,两者表达水平的差异比较具有显著性（X²=6.176,P=0.013）,与其在mRNA水平的表达情况一致。经统计分析,Cripto-1的表达与患者的年龄、性别及浸润深度的相关性P值均＞0.05;而与淋巴结转移、远处转移及临床分期则显著相关（P＜0.05）。转移组中Cripro-1的表达要高于未转移组,临床Ⅲ-Ⅳ期组要高于临床Ⅱ-Ⅰ期组,即Cripto-1阳性表达者淋巴结和远处转移发生率高,多为临床中晚期;Cripto-1阴性表达者转移发生率低,多为临床早期。上述实验结果提示我们Cripto-1在鼻咽癌表达上调,且与转移及临床分期显著相关。但其表达上调对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响以及调控的具体机制仍不明确。2.Cripto-1表达沉默对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响PCR和测序证实,成功构建了Cripto-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM/shCripto-1。包装慢病毒,并测得病毒滴度为4.2×10⁵TU/ml。慢病毒感染CNE2细胞,然后流式细胞仪分选鉴定GFP⁺细胞,荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效率后,建立了稳定干扰Cripto-1的鼻咽癌细胞株CNE2/GFP⁺/Cripto-1^-。采用MTT法检测Cripto-1基因沉默后细胞的体外增殖情况,结果显示,与CNE2/GFP⁺/pLVTHM和CNE2细胞相比,CNE2/GFP⁺/Cripto-1^-细胞的增殖速度显著减慢,并且呈时间依赖关系（F=32.364,P＜0.001）。平板克隆形成实验的结果同样显示CNE2/GFP⁺/Cripto-1^-细胞的增殖能力显著下降,三组细胞的增殖能力具有显著性差异（F=25.475,P=0.001）。流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期分布,结果显示三组细胞的细胞周期分布并无显著性差异。综上所述,Cripto-1表达沉默显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。采用Boyden小室检测Cripto-1基因沉默后细胞体外侵袭运动能力的改变,结果显示,与CNE2/GFP⁺/pLVTHM和CNE2细胞相比,CNE2/GFP⁺/Cripto-1^-细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少,差异具有显著性（F=153.754,P＜0.001）,CNE2/GFP⁺/Cripto-1^-细胞的侵袭能力显著降低。以上结果表明,Cripto-1基因沉默后显著降低了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。3.Cripto-1过表达对鼻咽癌细胞CNE1生物学特性的影响PCR、酶切及DNA测序鉴定Cripto-1真核表达载体pCI/CR-1,确认后以脂质体Lipofectmine^TM2000介导转染CNE1细胞,获得G418抗性单克隆,荧光定量PCR和Western blot确定Cripto-1过表达水平,建立稳定过表达Cripto-1的鼻咽癌细胞株CNE1/CR-1⁺。采用MTT法检测Cripto-1过表达后细胞的体外增殖情况,结果显示,与CNE1/neo和CNE1细胞相比,CNE1/CR-1⁺细胞的增殖速度显著增快,并且呈时间依赖关系（F=49.070,P＜0.001）。平板克隆形成实验的结果同样显示CNE1/CR-1⁺细胞的增殖能力显著提高,三组细胞的增殖能力具有显著性差异（F=5.861,P=0.039）。流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布,结果显示相对于CNE1/neo细胞,CNE1/CR-1⁺细胞的S期比例显著增加（t=12.441,P＜0.001）,G₀/G₁期比例显著减少（t=-5.083,P=0.007）。综上所述,Cripto-1的过表达显著促进了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。采用Boyden小室检测Cripto-1基因过表达后细胞体外侵袭运动能力的改变,结果显示,与CNE1/neo和CNE1细胞相比,CNE1/CR-1⁺细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数增多,差异具有显著性（F=106.081,P＜0.001）,CNE1/CR-1⁺细胞的侵袭能力显著增高。以上结果表明,Cripto-1基因过表达后显著提高了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。4.CNE1/neo和CNE1/CR-1⁺细胞的蛋白质组双向凝胶电泳分析运用凝胶内差异显示电泳技术对稳定过表达Cripto-1的CNE1/CR-1⁺及阴性对照CNE1/neo细胞进行了差异表达双向凝胶电泳分析,数字化图像分析发现有49个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著性差异表达（表达量相差2倍以上）,其中在CNE1/CR-1⁺细胞中表达量升高的蛋白质斑点有37个,表达量下降的蛋白质斑点有12个。质谱鉴定最终得到23个Cripto-1过表达前后的差异表达蛋白质,其中上调的有17个,下调的有6个。初步发现肿瘤相关蛋白DJ-1和1433G可能是Cripto-1活化PI3K-Akt和MAPK信号通路的协同作用者;转移相关蛋白ANXA3可能与Cripto-1促转移的作用相关。结论1.相对于鼻咽永生化上皮细胞NP69和鼻咽慢性炎组织,Cripto-1在鼻咽癌细胞株和组织中表达上调,且与鼻咽癌的侵袭与转移密切相关;2.Cripto-1基因沉默后显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力;Cripto-1过表达后则明显促进了鼻咽癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。Cripto-1与鼻咽癌的发生发展密切相关;3.2D-DIGE/MS分析所得的差异表达蛋白:DJ-1、1433G和ANXA3可能与鼻咽癌中Cripto-1的作用相关。本研究的创新之处:1.在mRNA和蛋白水平证实Cripto-1在鼻咽癌细胞株和组织中表达上调,且与鼻咽癌的侵袭与转移密切相关;为进一步理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断与分子靶向治疗靶点提供新线索。2.构建了Cripto-1敲低的慢病毒载体,建立了稳定的Cripto-1过表达和敲低的相关细胞克隆;为进一步了解Cripto-1在鼻咽癌发生发展中可能的作用及其机制提供了有效工具;3.初步证实Cripto-1与鼻咽癌的发生发展密切相关,在体外可以促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭;4.建立了Cripto-1过表达后CNE1细胞的荧光差异蛋白质表达图谱。发现肿瘤相关蛋白DJ-1和1433G可能是Cripto-1活化PI3K-Akt和MAPK信号通路的协同作用者;转移相关蛋白ANXA3可能与Cripto-1促转移的作用相关。