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砷是生物非必需且具有毒性的类金属,在自然界广泛存在,被世界癌症研究协会列为一级致癌物。环境中的砷主要是由于采矿、使用含砷除草剂和杀虫剂、燃烧化石燃料等自然或人为因素引起的。砷污染会对人体、植物以及微生物产生不同的危害,因此现在很多研究都在寻找减少砷污染以及减少砷对动植物及微生物的毒害的方法。已有许多研究表明,砷的甲基化是人和微生物减少砷毒害一条途径,但是在高等植物中尚未发现能将砷甲基化的基因,高等植物缺少甲基化无机砷的能力。利用转基因技术使高等植物具有砷甲基化及挥发能力是一种潜在的砷污染植物修复策略。根据已有的研究,推测真核生物的arsM基因具有较强的甲基化无机砷的能力,因此本研究课题将来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的CrarsM基因转入Col-0和Kr-0两个背景的拟南芥中,首次验证真核生物arsM基因在拟南芥中的砷甲基化功能。另外,课题组从砷污染的水稻土中分离出了噬纤维科(Cytophagaceae)的新菌株Arsenicibacter rosenii SM-1,该菌株的砷甲基化基因ArarsM具有较强的砷甲基化及挥发功能,因此本研究也验证了原核微生物的ArarsM在拟南芥中的砷甲基化功能。CrarsM和ArarsM基因通过农杆菌转化,转入Col-0和Kr-0两个背景的拟南芥中,经过潮霉素筛选、DNAPCR和cDNART-PCR分析,筛选出阳性苗并检验这两个arsM基因在拟南芥中的表达情况,结果表明CrarsM和ArarsM基因在两个背景的转基因拟南芥的地上部和根部都能稳定表达,选取能够稳定表达的转基因拟南芥株系进行后续实验。使用10和25 μM的三价砷[As(Ⅲ)]处理野生型(WT)和转基因拟南芥24或72小时,分别分析拟南芥地上部和根部的砷形态。结果显示,转基因株系地上部主要砷形态是二甲基砷(DMA);As(Ⅲ)则是根部主要的砷形态,DMA几乎检测不到。WT拟南芥中未检测到甲基砷化物。这些结果说表明CrarsM和ArarsM基因能在拟南芥中短时间内将大部分As(Ⅲ)甲基化,具有较强的砷甲基化功能;相对于ArarsM,CrarsM将无机砷转化为DMA的能力更强。平板耐性实验检测了转CrarsM和ArarsM基因拟南芥对砷的抗性是否有影响。将WT和转基因拟南芥的种子分别在含有0、10、20、30 μM As(Ⅲ)的1/2 MS培养基上生长20天后,拍照、测量植物鲜重和根长等生理数据。发现转基因株系相比于WT对As(Ⅲ)更为敏感,无论是地上部生物量还是根的伸长都受到明显的抑制。为了检测转基因拟南芥是否具有产生挥发性砷的能力,本研究设计了气态砷化物的收集实验。将使用10 μM As(Ⅲ)处理的WT和转基因拟南芥置于气体收集装置中,连接硝酸银浸泡过的硅胶粒,进行气体收集7天,每3天更换一次营养液。分析硅胶粒的砷形态,转基因株系能够检测到少量的三甲基砷氧化物(TMAO),说明CrarsM和ArarsM基因在拟南芥中也具有产生挥发性砷化物的能力,但效率较低;相比于CrarsM,ArarsM将As(Ⅲ)转化为TMAO的能力稍强一些。嫁接实验将CrarsM转基因株系和WT的地上部和根部互换,使用10 μM As(Ⅲ)水培处理3天后分析地上部和根部的砷形态,发现转基因拟南芥地上部和根部都能进行砷甲基化,根部的甲基化产物DMA很快转移至地上部。最后进行土培实验,使用10 μMAs(Ⅲ)分别在拟南芥的幼苗期处理1次、抽苔期处理2次。拟南芥成熟后收取种子,分析种子中砷的总量和形态。结果表明As(Ⅲ)为WT拟南芥种子中主要的砷形态,而转基因株系种子中除了部分无机砷外,还含有DMA和单甲基砷(MMA)。综上所述,CrarsM和ArarsM转基因拟南芥具有很强砷甲基化的能力,地上部和根部都能进行砷甲基化,根部的甲基化产物DMA很快转移至地上部,并且能产生少量的气态砷化物,但转基因植株却对As(Ⅲ)变得更为敏感,说明甲基化产物DMA对拟南芥毒性更大。