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肉毒毒素是肉毒杆菌产生的一种高分子蛋白神经毒素,是目前已知在天然与合成毒素中毒性最强的一种生物毒素。它主要是抑制乙酰胆碱神经递质的释放,从而引起肌肉麻痹,严重的会导致死亡。B型肉毒毒素在欧洲被称为Neurobloc,也是导致人类肉毒中毒的一种类型。目前有关B型肉毒毒素的研究较少,还没有B型肉毒中毒的救治药物和治疗方法。噬菌体抗体库Tomlinson I+J是由英国剑桥MRC HGMP(Human Genome Mapping)资源中心建立的,文库拥有1×108单链抗体scFv基因片段,库容量大,多样性高,在未知所筛选物克隆序列的情况下,利用这两个文库,可筛选得到高度亲和力的特异性抗体。因此,这将会为B型肉毒毒素中毒研制特效药及开发B型肉毒毒素抗体制剂奠定坚实的基础。鉴于肉毒毒素轻链在肉毒毒素中毒中的核心作用,本研究通过诱导表达B型肉毒毒素轻链蛋白,得到纯度达90%的蛋白。以此为抗原通过噬菌体抗体库Tomlinson I+J四轮富集筛选,得到数几十株阳性菌株,加诱导剂IPTG诱导表达抗B型肉毒毒素轻链的人源单链抗体。抗体活性的有无或大小至关重要,本实验采用的是绿色荧光蛋白标记法。GFP即绿色荧光蛋白,在蓝色波长范围的光线下激发,能产生绿色荧光,是一种活体报告蛋白。人工合成了SV蛋白的基因,其表达的蛋白质序列包含了SNAP25和VAMP中各型肉毒毒素的切割位点,将绿色荧光蛋白基因(GFP)与SV基因相连成重组基因GFP-SV,并克隆入pET-28a表达载体中,表达并纯化融合蛋白GFP-SV。利用GFP-SV作为底物,根据绿色荧光蛋白的荧光数值变化测定Bont-B抗体的活性。通过人源化噬菌体库筛选及活性检测,获得了三株具有Bont-B中和活性的抗体细胞株,其亲和常数分别为4H(4.38±0.445)×105L/mol,7A(5.35±0.903)×105L/mol,7B(1.146±0.525)×106L/mol。