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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种革兰氏阴性杆菌,极易导致医院内呼吸机相关性肺炎、囊性纤维化、尿路感染和全身感染。作为临床常见的致病菌,PA耐药机制复杂,极易形成生物被膜并能分泌多种毒力因子,使得传统抗生素难以发挥理想疗效,成为临床上治疗感染的重大挑战。中药及天然产物在抗感染方面受到越来越多关注。绿原酸是多种清热解毒中药的主要抗菌活性成分,进入体内后极不稳定,由多种代谢产物的形式存在,其代谢产物的抗细菌感染应用前景广阔,但代谢产物的抗菌活性尚未深入研究。本文筛选出绿原酸体内主要代谢产物中抗PA生物被膜活性较强的奎尼酸,研究奎尼酸对临床耐药PA生物被膜形成及消除成熟生物被膜、毒力因子及细菌运动能力等的作用,并采用RNA-Seq技术、荧光定量PCR、分子对接等分析方法探究奎尼酸对耐药PA药效作用靶点与机制,为奎尼酸及绿原酸相关代谢产物成为潜在的抗PA生物被膜药物及治疗相关感染性疾病提供理论依据及参考。本文分为下面三个部分:第一部分:奎尼酸对耐药PA体外药效作用。测定绿原酸及其12种主要代谢产物对PA1905的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并进行抗PA生物被膜试验。采用微量肉汤稀释法,发现奎尼酸对耐药PA1905的MIC50值为8 mg/m L,具有抗临床耐药菌的效果。通过结晶紫染色试验,奎尼酸在亚抑菌浓度（sub-inhibitory concentration,sub-MIC）为1/2MIC-1/32MIC范围能抑制PA生物被膜形成并消除成熟的生物被膜,最终筛选出抗PA1905生物被膜活性较强的奎尼酸进行后续实验。在扫描电镜下能清楚观察到PA形态结构,菌对照组细菌周围包裹着大量的网状生物被膜,给药组细菌周围的生物被膜附着量有所减少,sub-MIC奎尼酸抑制PA生物被膜形成的作用效果随着药物质量浓度增加而增强。将奎尼酸分别与克拉霉素、阿奇霉素及左氧氟沙星三种常用抗生素进行联合抗生物被膜实验,sub-MIC奎尼酸、克拉霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星对PA1905生物被膜的形成均表现出明显的抑制作用,奎尼酸与左氧氟沙星在部分sub-MIC条件下联用时具有协同抗BF作用,但大环内酯类药物与奎尼酸联合用药的抗BF增效作用有限。观察奎尼酸对PA1905绿脓菌素及弹性蛋白酶等毒力因子分泌的影响,当sub-MIC为1MIC-1/4MIC时,奎尼酸对PA1905绿脓菌素及弹性蛋白酶的分泌具有抑制作用,并且呈现一定的量效关系。第二部分:奎尼酸对耐药PA运动能力的影响。分析不同sub-MIC奎尼酸对PA1905浮泳及蹭行运动的抑制能力。奎尼酸在sub-MIC为4、2 mg/m L（相当于1/2MIC、1/4MIC）时PA1905浮泳运动能力减弱,所测菌落生长直径显著减小（P＜0.001）,明显抑制PA1905浮泳运动。奎尼酸在sub-MIC为4 mg/m L（相当于1/2MIC）时PA1905蹭行运动能力显著减弱（P＜0.001）;在sub-MIC为2、1 mg/m L（相当于1/4MIC、1/8MIC）时PA1905蹭行运动能力减弱（P＜0.01,P＜0.05）,明显抑制PA1905蹭行运动。第三部分:奎尼酸对临床耐药PA药效作用机理研究。通过RNA测序技术对subMIC奎尼酸处理的PA1905进行转录组学研究。同正常菌对照组相比,奎尼酸作用PA1905后共有590个基因发生明显变化,其中255个基因显著下调,335个基因显著上调;进行GO生物富集和KEGG通路分析,变化基因主要富集在主要富集于鞭毛装配、细菌趋化性、氧化磷酸化、核糖体、运动相关通路功能、氨基酸代谢相关通路、铜绿假单胞菌生物被膜形成及群体感应相关功能等。荧光定量PCR显示与QS系统相关基因变化情况,相比于菌对照组,sub-MIC奎尼酸作用后下调了PA1905中Rhl R、Las A、Las R、Rhl I、Las I基因表达,与转录组学结果一致。通过分子对接方法发现奎尼酸六元环结构周围存在大量芳香族氨基酸残基,奎尼酸能分别与PA中的群体感应通路关键蛋白（Rhl R、Rhl A和Rhl B）通过氢键及疏水作用形成复合物,与它们的内源性配体竞争,从而干扰PA的群体感应系统。综上所述,本文通过对比绿原酸及其12种主要代谢产物抗PA1905生物被膜的活性,以抗PA生物被膜活性较强的奎尼酸为研究对象;在扫描电镜下清晰直观地观察subMIC奎尼酸对耐药PA1905生物被膜的抑制作用效果;奎尼酸在sub-MIC为1MIC-1/4MIC时能抑制PA1905绿脓菌素及弹性蛋白酶两种重要毒力因子的分泌;奎尼酸对PA1905浮泳及蹭行运动影响;通过转录组学分析sub-MIC奎尼酸对PA1905的作用效果,主要抑制鞭毛装配、细菌趋化性、氧化磷酸化、核糖体、运动相关通路功能、氨基酸代谢相关通路、铜绿假单胞菌生物被膜形成及群体感应相关功能;进行荧光定量PCR分析,发现奎尼酸下调了Las A、Las R、Las I、Rhl I、Rhl R与群体感应相关基因的表达;通过分子对接方法发现奎尼酸六元环结构周围存在大量芳香族氨基酸残基,奎尼酸能与Rhl R、Rhl A和Rhl B结构上的芳香族氨基酸残基形成多个氢键,这些基团在一定程度上限制了奎尼酸的分子流动性,增强了奎尼酸与三种蛋白质的结合亲和力,进一步限制Rhl系统靶蛋白的结构及功能;并分析与细菌的第二信使环二鸟苷酸相关的鞭毛结构基因Flg B、菌毛结构基因Pil G基因表达量的变化情况。以上研究结果证明这些靶点、通路及生物学过程很可能是奎尼酸抗PA1905生物被膜的作用机理,为奎尼酸成为潜在的抗感染药物提供参考。