牙周膜细胞，包括牙周膜成纤维细胞(PDLFs)、成骨细胞及成牙骨质细胞等，它们是牙周组织再生和形成新附着的重要成分，但是牙周炎症或创伤时牙周膜再生细胞数量的减少以及生物学功能的降低阻碍了牙周组织的完全再生。牙周膜细胞是一组来源相同，细胞结构和功能不完全相同的细胞。 体外培养是研究细胞功能的良好实验模型，具有样本同源性强、实验条件易于控制、便于连续观察等优点。本实验采用组织块原代培养法，建立人PDLC的有限细胞系，并观察其生物学性状，为进一步的工作奠定基础。牙周组织的修复再生是一个多因素调控的过程，而牙周膜细胞的作用至关重要，牙周膜细胞包括有不同功能的成熟细胞和具有分化潜力的未分化细胞，后者也称为前体细胞，约占40％，是新生细胞的来源，可分化为成熟细胞：成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等，这些是牙周组织修复的关键细胞，有利于牙周组织的再生和新骨、牙骨质的形成。此外，牙周膜细胞能合成和分泌大量胶原物质，其有利于牙周再生。目前研究表明，多种生长因子对成纤维细胞增殖分化和细胞外基质合成有促进作用。 牙周膜细胞的基本功能之一是合成和分泌蛋白，组织形成也是在此基础上进行的，因而合成和分泌蛋白是牙周膜细胞的重要功能指标之一。牙周膜细胞的蛋白成分除了组成本身结构和维持生存、增殖必需的蛋白外，主要是与细胞功能密切相关的蛋白成分，可分为胶原蛋白和非胶原蛋白。 一.牙周韧带细胞的体外培养研究 目的：满足体外培养牙周膜韧带细胞的需要方法：本实验采用组织块原代培养法，建立人PDLC的有限细胞系，并观察其生物学性状，为进一步的工作奠定基础。结果：1.组织块培养法培养2天时，在组织块周围见梭形或纺锤形成纤维样细胞，呈放射状向四外长出。继续培养3天换液，组织块和未帖壁细胞基本被去除。继续培养3天后，再次换液。第8天，细胞长满培养瓶底的80％，进行第一次细胞传代。2.将PDL细胞接种于24孔板后的第3天，细胞出现融合现象。细胞在孔底呈鳞片状。待融合率达到80％以上时，吸出培养液，改用条件培养液继续培养，可见细胞逐渐形成多层，细胞形态变小，突起变钝。3.①DEX对细胞增殖能力的测定：MTT法测定的OD值与活细胞数成显著正相关性，即MTT法可衡量不同浓度的DEX对PDL细胞增殖的影响。从图中曲线可知(表2-1)，条件诱导液的存在，可抑制PDL细胞的增殖，但不同浓度的DEX对其影响程度不同，即随着浓度的增加，增殖能力逐渐降低：呈负相关趋势。 结论：1通过正畸牙齿获得PDL细胞，进行分离和体外培养是可行的。2DEX对于PDL细胞的生物学作用是显著的：在DEX存在的条件下，促进PDL细胞的增殖能力，并且随着DEX浓度的增加，其促进作用呈正相关。对DEX处理的PDL细胞进行骨桥素mRNA的原位杂交实验表明，DEX的存在，会显著影响PDL细胞的细胞表型特征。3本实验说明，体外培养PDL细胞时，加入相应的细胞诱导物，可以明显改变细胞的生物表型，从而使细胞表现很强的增殖活性。 二.胰岛素样生长因子Ⅰ真核表达载体构建及转染PDLC细胞作用的研究 目的：深入地探讨IGF对PDLC细胞增殖的作用，为临床预防、治疗牙周病提供科学依据方法：本实验的目的是通过分子克隆方法获得重组IGF，进一步通过体外等一系列实验方法，从基因水平到蛋白质水平，研究IGF对于pdlc细胞的作用。结果：1.本试验成功的获得了序列正确的IGF片断全长2.成功地构建了插入正确IGF序列的真核表达载体。3.成功地转染入pdlc细胞4.证明了转染后，pdlc细胞表达IGF增强5.转染pdlc细胞后，pdlc细胞表现增殖活化，同时，引起骨桥素表达增强。结论：1.利用巢式RT-PCR的技术成功地从人新鲜胎盘组织中扩增出了IGF的cDNA片段；2.通过Westernblot方法检测证实，利用脂质体的方法将pcDNA-IGF真核表达载体转染入PDLC细胞后，获得IGF高表达；3.转染了pcDNA-IGF真核表达载体的PDLC细胞可以在培养液中继续生长，从而获得了高表达IGF的PDLC细胞，为后续试验奠定了基础；4.转染了IGF的PDLC细胞的生长、增殖、克隆形成能力增强，提示IGF能够促进PDLC细胞的生长、增殖及分化能力；5.成功的证明了转染IGF的PDLC细胞，表达丰富的骨桥素蛋白，为进一步解释生长因子促进牙周膜生长提供了理论依据，为深入探讨生长因子治疗与预防牙周病奠定了坚实的实验基础。