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本文从以下几方面进行论述： 第一章 小鼠OG-MEF细胞重编程过程中细胞动力学研究 诱导多能性干细胞相比胚胎干细胞具有无可比拟的优越性，已经成为研究细胞增殖、分化和再生医学的重要技术手段。前人的研究发现，iPSCs的产生过程中细胞将经历三种形态变化:成纤维细胞型(MEF)→上皮样细胞→胚胎干细胞样克隆(iPSCs)，了解重编程过程中三种不同形态细胞的动力学变化，对于阐明iPSCs的重编程机理以及提高其诱导效率具有重要作用。为此，本研究建立了无饲养层条件下诱导iPSCs的技术方法，同时比较了两种不同的培养液添加物（血清和血清替代物）对于iPSCs诱导效率的影响。进而，利用Thy1、SSEA1两种抗体染色和Oct4-GFP报告系统，对重编程过程中PD3、PD6、PD9、PD12细胞的动力学变化规律进行了分析。结果显示，含血清替代物的培养液中iPSCs的诱导效率显著高于血清培养液(15.2％ vs2.59％)，且含血清替代物培养液中诱导获得的iPSCs在细胞克隆形态，Oct4-GFP表达等方面明显优于血清培养液。进而，本研究利用无饲养层及血清替代物培养液为诱导系统，对诱导过程中PD3、PD6、PD9、PD12天的细胞染色进行流式分析，探讨重编程过程不同阶段细胞特性标记的动力学变化。结果显示，在PD3时，Thy1+SSEA1-细胞占68.6％，Thy1-SSEA1-细胞占23.8％，Thy1-SSEA1+细胞占6.63％。PD6时，Thy1+SSEA1-细胞数量显著降低至16.8％，而Thy1-SSEA1-细胞达到55.1％，Thy1-SSEA1+细胞数量显著提升至27.3％，所以在重编程的早期，细胞表面标记的变化为Thy1+ SSEA1-细胞→Thy1-SSEA1-细胞→Thy1-SSEA1+细胞。PD9时， SSEA1-GFP+细胞所占比例为12.6％，SSEA1-GFP-所占的比例为18.2％，SSEA1+GFP+细胞所占的比例为51.7％，在PD12时，SSEA1-GFP+细胞所占的比例上升为23.8％，SSEA1-GFP-细胞所占的比例下降到11.6％，而SSEA1+GFP+细胞所占的比例上升到57.5％。所以诱导的后期，重编程细胞由SSEA1+GFP-细胞→SSEA1+GFP+细胞。因此，整个重编程过程中细胞特性标记的动力学变化规律为，Thy1+SSEA1-GFP-→Thy1-SSEA1-GFP-→Thy1-SSEA1+ GFP。→Thy1-SSEA1+GFP+。将流式分选的Thy1-SSEA1+GFP+细胞接种于饲养层上进行培养，形成的iPSCs克隆形态均一，生长状态良好，克隆边缘整齐、有明显的遮光，且都表达GFP绿色荧光，碱性磷酸酶染色都呈阳性。对其进行免疫荧光染色分析显示，多能性标记蛋白Oct4、Sox2、Nanog、 E-cadherin、SSEA1均呈阳性染色。该iPSCs能够体外分化形成类胚体，并表达三胚层标记蛋白，Nestin（外胚层）、Brachyury（中胚层）和Gata4(内胚层)。 第二章 牛TWSIN1-OG细胞诱导重编程的初步研究 体细胞导入特异性转录因子，可将已分化的细胞重编程为具有干细胞特性的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），iPS技术为牛、羊、猪等胚胎干细胞建系困难的大家畜动物提供一种获得多能干细胞的新途径。虽然目前已获得了具有部分多能性的牛iPSCs，但这些iPSCs都不能在体外进行长期培养，并依赖外源转录因子的长期表达来维持克隆形状，而内源干细胞调控网络并没有被激活，当转录因子的表达被沉默后，iPSCs立即分化，且不同研究所获得的iPSCs在细胞形态和多能性基因的表达等方面还存在明显差异。将Oct4-GFP报告系统应用于iPSCs重编程，为判断重编程过程中内源干性网络的是否激活提供了有力的技术手段。本研究构建了含有人Oct4-GFP报告基因的牛胎儿成纤维细胞（TWSIN1-OG），用以判断牛iPSCs诱导重编程过程中内源干性网络的激活。通过将人源的OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、LIN28(OSKMNL)导入TWSIN1-OG细胞，进而诱导牛iPSCs。当使用不同体积的病毒感染细胞，通过DsRed红色荧光蛋白指示感染效率，结果显示，使用10μl、20μl、30μl、40μl病毒的感染效率分别为54.3％、62.2％、74.8％、79.3％。进而确定使用40μl的OSKMNL病毒进行牛iPSCs的诱导，观察诱导过程中细胞的形态变化。结果显示，与小鼠类似，在诱导第三天细胞开始由成纤维细胞型向上皮样细胞转变，第六天上皮样的细胞开始向上聚集，第九天有初始形状的克隆形成，第十二天克隆不断长大。在第十三天至二十二天挑取形态比较好的克隆进行扩大培养，但这些细胞都不能稳定长期传代，且没有观察到Oct4-GFP的表达。在后续的研究工作中，我们将继续对于牛iPSCs的诱导系统进行优化，希望最终能够建立体外可长期培养，并且稳定激活内源干性网络的牛诱导多能干细胞。