在奶牛的繁育过程中,奶牛的早期妊娠诊断非常重要。早孕因子(early pregnancy factor,EPF)是目前所知最早确认妊娠的生物化学标志物之一,是显示胚胎成活力的敏感标志。血清中早孕因子的检测可以预测胚胎的形成,监测胎儿生长状态,检测胚胎的早期消失。如果能在家畜上利用EPF进行早期妊娠诊断,可以在配种后很短的时间内鉴别奶牛是否受孕,此技术缩短产犊间隔,节约生产成本,提高奶牛的繁殖率,同时也有利于育种员及时掌握配种情况,在实际生产中具有重要意义。本研究运用基因工程技术克隆奶牛EPF基因,构建原核表达载体p ET32a-EPF,获得奶牛早孕因子重组蛋白,通过切胶纯化的方法对表达的蛋白进行纯化,最终建立了奶牛早期妊娠诊断的间接ELISA检测方法。利用该方法对怀孕28天的奶牛血清样品进行检测,结果发现,鼠抗牛EPF多克隆抗体与孕酮、人绒毛膜促性腺激素均不发生交叉反应;早孕因子重组蛋白的最低检出限为320ng/m L;妊娠奶牛血清样本的敏感性为91%(n=100);批内和批间重复性试验变异系数均低于10%;与美国爱德士牛怀孕检测试剂盒的检测结果对比,本研究建立的ELISA检测方法符合率为81.97%;对间接ELISA法检测结果进行统计学分析表明,妊娠奶牛(n=99)比空怀奶牛(n=92)血清中EPF活性高,且差异极显著(P<0.01);2~3岁妊娠奶牛(n=55)血清中EPF活性比4~5岁妊娠奶牛(n=28)高,且差异极显著(P<0.01);2~3岁妊娠奶牛(n=55)与6~7岁妊娠奶牛(n=10)血清中EPF活性差异不显著;不同胎次奶牛血清中EPF活性差异均不显著。上述结果表明,本实验建立的基于奶牛早孕因子检测的奶牛早孕诊断间接ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,能够有效检出受孕奶牛的血清样本,为奶牛的妊娠诊断提供技术支持。