目的:胶质瘤是成人中最常见的颅内原发性恶性肿瘤。虽然目前采用手术,放疗和放疗等综合治疗方法,但患者的预后仍然较差。根据世界卫生组织(WHO)的分类,胶质母细胞瘤(GBM,胶质母细胞瘤)是最恶性的胶质瘤,GBM预后不良的主要原因是其复发率高。尽管近年来联合使用替莫唑胺和标准放疗,但原发性GBM患者的平均生存期仅为14.6个月,5年生存率仅为9.8%。基于个体患者的GBM基因表型的变化可能是个体化治疗的突破。微小RNA(miRNA)是一类短的非编码RNA分子,参与一系列重要的生物过程,如细胞增殖,凋亡,代谢和分化。最近的研究证实,miRNA在不同人类肿瘤的产生,血管生成,侵袭和凋亡中起重要作用。相当多的研究表明恶性胶质瘤中某些特定miRNA的表达失调。在我们最近的研究中,我们发现miR-196a在高级别胶质母细胞瘤中的表达明显高于非肿瘤脑组织,但miR-196a在胶质瘤中的特定作用和机制尚不清楚。在本实验中,我们克隆了成熟microRNA-196a的序列,并对其在胶质瘤细胞中的生物学功能进行了初步研究。在该研究中,我们用慢病毒载体感染神经胶质瘤细胞系并建立稳定的细胞系,其过表达miR-196a和抑制miR-196a表达的稳定细胞株;采用CCK-8法,PI检测细胞周期法和Trans-well法检测miR-196a对胶质瘤细胞生长,迁移,侵袭和凋亡的影响;miR-196a对裸鼠皮下异种移植模型体内胶质瘤生长的影响;生物信息学软件预测结合基因芯片分析方法是寻找miR-196a的下游靶基因,并通过双荧光素酶报告系统和Western blot验证。最后,我们通过过表达靶基因并模拟挽救实验来验证miR-196a是否是通过其靶基因发挥生物学作用。我们的结果显示抑制胶质母细胞瘤细胞系U87和U373中miR-196a的表达抑制胶质瘤细胞增殖,细胞周期进程和活性,同时抑制胶质瘤细胞的细胞周期。在分子机制研究中,我们发现miR-196a过表达促进周期相关蛋白cyclin D1和pRB的表达,同时抑制周期相关蛋白p27Kip1的表达。在胶质瘤细胞中,我们发现miR-196a的过表达下调GATA6的表达,并证实miR-196a对胶质瘤生物学行为的影响在一定程度上通过抑制GATA6实现。综上所述,我们的结果提供了足够的证据来证明miR-196a在神经胶质瘤发展中的重要作用。研究方法:1、细胞培养:将人神经胶质瘤细胞U87和U373细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,并将两种细胞在37℃,5%CO2培养箱中培养。并用干细胞培养基培养U87源胶质瘤干细胞GSC U87及GSC 1295。2、LV-miR-196a-GFP慢病毒感染的细胞:细胞系U87和U373被含有成熟miR-196a序列的慢病毒载体(Shanghai Jikai Biotech Co.,Ltd。)转染并用绿色荧光蛋白标记,并在荧光显微镜下观察绿色荧光强度以评价转染效率。将过表达miR-196a与抑制表达miR-196a的细胞株稳定培养,并用含有miR-NC作为对照组的病毒载体感染细胞。3、CCK-8法测定细胞增殖活性:将构建的miR-196a过表达细胞、抑制miR-196a表达的细胞、miR-196a过表达同时GATA6过表达细胞与miR-NC细胞接种于96孔板(每孔2000个细胞)中,并铺板总共5个板。将每个孔与CCK-8在黑暗中温育2小时,并用酶标仪测量450nm处的吸光度5天。绘制细胞增殖曲线。4、流式细胞仪分析细胞周期:在测试之前,将细胞培养基更换为无血清DMEM以进行同步。收集细胞后,将细胞在4%的70%冰乙醇中固定2小时,含有25mg/ml PI(碘化丙锭)和10mg/ml RNA。酶抑制剂用PBS染色并在黑暗中于37℃温育30分钟;通过流式细胞术检测DNA含量,并记录488nm处的红色荧光并通过Modifit软件分析。5、胶质瘤干细胞成球试验:实体肿瘤以三维(3D)空间构象生长,导致氧气和营养素的不均匀暴露以及其他物理和化学应力。为了模拟3D空间构象,3D体外培养模型已经用于癌症研究。癌症干细胞(CSC)被定义为肿瘤内的一小部分细胞,具有自我更新的能力,并且经常在化学疗法治疗后驱动肿瘤进展和复发。传统上,癌症干细胞已从癌细胞系和肿瘤活组织检查中分离出来,并在3D肿瘤球体悬浮培养物中生长。为了促进细胞的成球生长和防止细胞贴壁,结合使用无血清培养基(加入B27和合适浓度的生长因子)。使用1%浓度的甲基纤维素(methyl cellulose)抑制细胞聚集。使用上述方法培养10-14天以后,计算直径大于75um的细胞球的个数。超过70μm的细胞筛收集培养10-14天后的细胞球,使用胰酶消化成单细胞,将合适数量的细胞铺入96孔板继续进一步培养10-14天,统计细胞球的个数,计算SFE(SFE=每孔中直径大于75um的细胞球的个数/每孔中原始接种细胞的总数)。6、侵袭能力检测:(1)将枪头,Transwell室,Matrigel胶和Eppendorf管在4°C预冷1小时;(2)将细胞重悬于PBS中1次洗涤,并在无血清培养基中稀释;(3)稀释Matrigel凝胶至1 ng/nL;将50jxL加入Transwell小室的上端,在培养箱中加1小时间储备;Transwell小室外加入800^10%FBS完全培养基,然后在室的上端加入100μL细胞悬液,每组三个重复孔,置于5%CO 2恒温培养箱中24小时;(4)取出腔室,棉签擦除腔室上端的细胞;(5)在室温下用1:1甲醇和丙酮的混合溶液固定10分钟;(6)自来水冲洗3次,结晶紫染色30分钟;(7)将自来水冲洗3次,干燥,用刮刀切割薄膜,密封胶状物;(8)在显微镜观察记录下,每组随机抽取三个视野。7、裸鼠肿瘤形成实验:使用12只BALB/C-null裸鼠(Beijing Weitong Lihua Biotechnology Co.,Ltd。)。将裸鼠置于中国医科大学动物实验中心的无菌无层流无特定病原体(SPF)环境中,高压灭菌水和饲料自由消耗。将12只小鼠等分为实验组(miR-196a)对照组(miR-NC),将100μl(1×10 7个细胞)的肿瘤细胞悬浮液皮下注射到每只裸鼠的侧面。使用游标卡尺每周测量肿瘤的长直径(D)和短直径(d)。根据公式肿瘤体积(V)=(D×d2)/2mm3,在6周后处死小鼠,称重肿瘤。8、mRNA芯片分析:在miR-196a过表达的mRNA表达分析后,改变U87细胞中的mRNA表达,并且选择具有超过2倍的表达降低和统计学显着性的mRNA(P<0.05)作为miR-196a的潜在靶基因。9、生物信息学分析:miR-196a的靶基因分别由靶基因预测软件Targetscan,miRanda和PITA预测,并将结果汇总以获得交叉点。将该交叉的结果和mRNA芯片分析的结果组合以确定最可能的miR-196a靶基因。10、双荧光素酶报告基因检测:野生型或突变型GATA6-3’-UTR荧光素酶报告载体由广州瑞博生物技术有限公司设计和合成。将HEK293细胞接种于96孔板中24小时,转染前达到80%汇合。将100ng野生型或突变型GATA6-3’-UTR荧光素酶报告载体,总浓度100nmol miR-196a模拟物或miR-NC模拟物共转染到HEK293细胞中。使用双重荧光素酶报告系统(Promega)在转染后24小时检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。使用海肾荧光素酶活性作为标准,使用萤火虫荧光素酶活性作为标准化转染效率的参考。11、免疫荧光:将miR-196a细胞和miR-NC细胞均匀地铺板在24孔板中,细胞融合约40%。第二天用4%多聚甲醛固定细胞,用PBS洗涤3次,用5%BSA工作溶液封闭1小时,并在1℃温育过夜。第二天在室温下加入第二天1小时,用DAPI染色细胞核15分钟,然后在倒置荧光显微镜下观察。第一抗体是GATA6(1:200,Abcam),第二抗体是TRITC(1:200,Proteintech)。12、瞬时转染:GATA6-pcDNA3.1和Empty-Vector载体的构建由广州瑞博生物技术有限公司完成,转染试剂为Invitrogen的Limpofectamine 2000。转染后48小时收集细胞用于后续实验。13、Western Blot:含有1%PMSF的RIPA细胞蛋白裂解物切割从胶质瘤细胞和移植的肿瘤组织中提取的蛋白质,并根据分子量,使用8%-15%浓度的SDS-PAGE凝胶通过电泳分离蛋白质。转移至PVDF膜,用5%脱脂乳封闭2小时,并通过向4℃摇床中加入一抗孵育过夜。抗体浓度为GATA6(1:5000,Abcam),细胞周期蛋白D1(1:2000,CST),细胞周期蛋白E1(1:2000,CST),PARP,切割的PARP(1:1000,Santa Cruz),半胱天冬酶-3,cleaved-caspase-3(1:1000,Santa Cruz),pRB(1:1000,Ser780,CST),内部参照是β-肌动蛋白(1:2000),第二天与相同来源的二抗孵育,使用ECL方法发光并拍照。14、统计分析:通过t检验对组间差异进行统计学分析,分析工具为SPSS和R。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、过表达miR-196a促进胶质瘤细胞的增殖:通过慢病毒介导的稳定感染建立稳定表达和过表达神经胶质瘤细胞系U87和U373并抑制miR-196a和GFP表达的细胞系。CCK-8的结果显示miR-196a过表达促进胶质瘤细胞U87和U373的生长;细胞周期实验表明,miR-196a过表达促进细胞周期从G1/G0进展到S期。Western blot结果显示,miR-196a过表达促进周期相关蛋白cyclin D1和pRB的表达,并抑制周期相关蛋白p27Kip1的表达。2、过表达miR-196a可促进胶质瘤细胞的侵袭:Trans-well实验表明,miR-196a的过表达促进了神经胶质瘤细胞的侵袭。此外,Western blot结果显示,miR-196a过表达促进了间质相关蛋白ZEB1和MMP2的活化,并抑制了上皮相关蛋白E-钙粘蛋白的表达。3、GATA6是miR-196a下游的靶基因:结合微阵列分析和靶基因软件预测的结果,GATA6是miR-196a的潜在靶基因。通过双荧光素酶报告基因测试共转染miR-196a模拟物和野生型GATA6 3’-UTR。当报道基因载体时荧光素酶活性降低,并且当用miR-196a模拟物和突变体GATA63’-UTR的报告载体共转染时荧光素酶活性没有变化。因此,我们认为miR-196a可以与GATA6 3’-UTR位点结合。通过随后的细胞免疫荧光和Western印迹证实GATA6是神经胶质瘤中miR-196a的靶基因。4、miR-196a通过抑制GATA6的表达促进胶质瘤细胞的增殖并促进向间质表型的转变:在过表达miR-196a的细胞系中,过表达GATA6的表达水平并分析生物学行为。结果表明,由于miR-196a,GATA6过表达可以在一定程度上降低肿瘤细胞增殖的能力,同时抑制miR-196a促进胶质瘤细胞向间充质表型转化的能力。结论:1、miR-196a促进胶质瘤细胞的生长并促进其侵袭。2、GATA6是miR-196a的下游靶基因。3、miR-196a通过抑制GATA6的表达抑制胶质瘤细胞增殖并促进其向间充质表型转化。