研究背景膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,在我国发病率位于泌尿系统肿瘤首位。大约25%的膀胱癌初发患者是肌层浸润性膀胱痛,尽管另外75%的膀胱癌患者为非肌层浸润性膀胱癌,但大部分出现复发或侵犯肌层。早期手术是治疗膀胱癌的关键,术后常规膀胱灌注化疗可以有效降低术后复发率,改善患者预后和提高生存率,但仍有2/3的患者会出现复发,并且复发患者中15%-20%会进展为更高的病理分期和/或伴有分级升高。大部分膀胱癌相关死亡是因为肌层浸润性膀胱癌导致的局部浸润或远处转移。较高的死亡率要求泌尿外科医师寻找新的更有效的治疗方案治疗米膀胱癌。近年来,尽管吉西他滨(Gemcitabine)顺铂(Cisplatin)新型GC联合方案作为一线的晚期膀胱癌化疗措施疗效显著,但耐药的发生大大的限制了远期疗效。吉西他滨广泛应用于胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等肿瘤。然而,越来越多的泌尿外科医师意识到了吉西他滨耐药带米的危害。尽管膀胱癌患者最初的化疗效果显著,但60～70%有效的患者5年内出现复发,平均生存期仅有12～14月,这要归因于在治疗过程中出现的耐药现象。肿瘤细胞对吉西他滨产生耐药的机制目前还不清楚。Nakahira S在胰腺癌的研究中发现吉西他滨的耐药与RRM的高表达相关。核苷酸还原酶(Ribonucleotide Reductase, RR)由2个亚基组成,较大的M1和较小的M2。 RRM1是酶的结合位点,而RRM2与RR的活性有关。RRM1被认为是吉西他滨耐药过程中重要的药物代谢酶。它不仅是吉西他滨作用的分子靶点,而且是肿瘤抑制剂。基础研究证实RRM能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和代谢。在一些肿瘤中,RRM2 mRNA的高表达与化疗耐药、细胞侵袭和较差的预后相关,提示RRM2与肿瘤的进展有关并且是一个潜在的治疗靶点。然而,目前为止仍没有关于RM1和RRM2蛋白在吉西他滨膀胱癌中研究的报道。此外,最近的一些研究提示RRM在人类肿瘤发展中起到了重要的作用,但在膀胱癌中RRM表达的意义尚不明确。临床资料显示吉西他滨耐药的患者预后差,因此,对吉西他滨耐药膀胱癌的治疗非常重要。越来越多的研究证实靶向治疗对膀胱癌患者非常有效。但目前为止尚未发现有RRM相关的靶向抑制剂问世。而我们之前的研究显示在体内和体外实验中Eg5抑制剂S(MeO)TLC作为靶向药物治疗膀胱癌和前列腺癌疗效显著。Eg5是双极纺锤体形成过程中的关键因子,是抗有丝分裂药物的关键酶。纺锤体驱动蛋白Eg5在细胞有丝分裂过程中发挥关键作用,近年来成为了靶向抗癌治疗的研究热点。Eg5在增殖组织细胞中表达,其主要功能与双极纺锤体的形成和分离有关,在细胞有丝分裂早期中起到了关键作用。目前已有许多小分子Eg5抑制剂被报道,其中S-(4-methoxytrityl)-L-cysteine(S(MeO)TLC),一种S-trityl-L-cysteine(STLC)的衍生物,能够诱导单星纺锤体的形成,其作用是STLC的10倍。Eg5的功能使其成为肿瘤靶向治疗的热点,但目前为止尚无Eg5抑制剂治疗吉西他滨耐药膀胱癌方面的研究报道。目的本研究首先探讨RRM1和RRM2蛋白表达水平与吉西他滨耐药膀胱癌生物学行为及术后预后间的关系；进而研究靶向抑制齐S(Me0)TLC在体外和体内试验中对吉西他滨耐药膀胱癌的治疗效果。方法(1)首先采用梯度培养的方法逐渐建立吉西他滨耐药膀胱癌细胞系RT112-Gr,通过MTT法测定吉西他滨半数药物抑制浓度IC50了解RT1 12-Gr细胞的耐药情况；基因芯片技术分析吉西他滨耐药膀胱癌细胞系RT1 12-Gr及其亲代细胞RT1 12之间的差异,结合其他相关研究报道筛选与耐药相关的分子靶标；通过RT-PCR方法检测RT1 12-Gr及RT112细胞之间RRM1和RRM2表达的差异,进-步采用siRNA分别沉默RRM1和IRRM2基因,鉴定沉默的效率并检测沉默RRM1和RRM2基因后的RT1 12-Gr细胞对吉西他滨治疗敏感性的变化。(2)采用免疫组织化学染色的方法检测了108例膀胱癌临床标本中的RRM1和RRM2表达,分析RRM1和RRM2蛋白表达水平与肿瘤生物学行为指标之间的关系,并通过生存分析研究了RRM1和RRM2表达水平与108例膀胱癌患者术后吉西他滨化疗治疗后的预后间关系。(3)我们利用cBioPortal软件(http://www. cbioportal. org/public-portal/)作为网络分析工具分析癌症基因组图集(The Cancer Genome Altas,TCGA)数据库(http://cancergenome.nih.gov/)筛选膀胱癌中与RRM1和RRM2基因共表达的相关基因,目的就是为了寻找RRM1和RRM2通路中存在靶向抑制剂的蛋白,通过联合该耐药通路的阻断,解决吉西他滨耐药的难题。(4)体外实验：采用MTT及台盼兰染色细胞活性实验对比S(MeO)TLC、吉西他滨、S(MeO)TLC+吉西他滨、对照组对吉西他滨耐药膀胱癌细胞增殖的抑制能力,并进一步通过Heochst细胞凋亡实验和流式细胞仪检测药物诱导细胞凋亡的效果和机制。采用蛋白印迹技术检钡Caspase凋亡通路蛋白,探讨S(MeO)TLC诱导吉西他滨耐药膀胱癌凋亡的分子通路机制。(5)体内实验：采用吉西他滨耐药膀胱癌细胞株RT1 12-Gr建立裸鼠皮下肿瘤模型,研究S(MeO)TLC的体内抗癌疗效；通过经腹腔注射S(MeO)TLC,观察S(MeO)TLC抑制膀胱癌皮下肿瘤生长情况。结果(1)MTT检测RT112-Gr细胞吉西他滨半数抑制浓度(IC50)为42 nmol/L,是其亲代细胞RT112的350倍(RT112 IC50值为12nmol/L),并且对吉西他滨耐药的细胞RT112-Gr对阿霉素及顺铂并无交叉耐药性。本实验通过基因芯片技术分析吉西他滨耐药膀胱癌细胞株RT112-Gr与亲代细胞RT112中基因表达的差异。结果显示在人类基因芯片的55752个基因中,442个基因表达显著上调,235个表达显著下调。其中,、RRM1 P值为0.046,RRM2为0.021。我们通过聚类分析共筛选出227个基因。我们应用RT-PCR 方法检测了膀胱癌细胞RT1 12及RT112-Gr中RRM1/2的表达,结果显示吉西他滨耐药膀胱癌细胞RT1 12-Gr中RRM1和RRM2mRNA表达均明显增高,与其亲代膀胱癌细胞RT112相比,分别增加了4倍和10倍(P<0.001)我们应用脂质体介导siRNA对RT112-Gr进行RRM1及RRM2基因沉默。MTT检测RRMI及RRM2基因沉默后吉西他滨耐药细胞株对吉西他滨体外治疗的敏感性明显增加(P<0.01)。(2)我们通过免疫组化染色的方法检测了108例膀胱癌患者组织标本中RRM1和RRM2的表达,结果发现所有患者标本均有阳性表达。我们进一步分析了RRM1和RRM2蛋白表达水平与患者临床指标及病理参数之间的关系,结果显示肿瘤大小、分期、分级与RRM1蛋白表达水平有明显相关性(P值分别为0.023.0.01.0.048).RRM2蛋白表达水平与肿瘤大小、分期、分级有明显相关性(P值分别为0.004、0.018、0.008)。通过Kaplan-Meier生存曲线单因素生存分析结果显示肿瘤大小(P<0.001)、分期(P<0.001)、分级(P<0.001)RRM1(P=0.022)和RRM2(P=0.016)蛋白表达水平高低与肿瘤无复发生存时间显著相关。通过Cox比例风险模型进行多因素变量分析,结果显示肿瘤分期(P=0.005)、分级(P<0.001).RRMl(P=0.045)和RRM2(p=0.033)蛋白高表达是膀胱癌术后吉西他滨化疗患者无复发生存时间的独立不利预后因素。(3)我们进一步通过cBioPortal软件分别分析TCGA数据库中膀胱癌组织RRMl.RRM2 与Eg5(KIF-11)mRNA共表达的情况,结果显示RRM1、RRM2与Eg5基因存在共表达趋势,RRM2与Eg5表达相关性较RRM1更高,RRM1、RF M2与Eg5的Pearson相关系数分别为0.60、0.71； Spearman秩和相关系数分别为0.71、0.76。我们提出假设,吉西他滨处理的肿瘤细胞大部分凋亡,但有部分肿瘤细胞通过上调RRM1或RRM2而存活,二者又进一步上调Eg5而促进增殖,进而发展成吉西他滨耐药膀胱癌。(4)MTT检测RT112-Gr-细胞S(MeO)TLC半数抑制浓度(IC50)为290nmol/L,而其亲代细胞RT112的IC50值为210nmol/L.台盼兰染色检测S(MeO)TLC能有效抑制吉西他滨耐药膀胱癌细胞RT112-Gr的体外增殖。我们应用Heochst细胞凋亡实验和流式细胞仪检测并分析S(MeO)TLC作用于RT112-Gr细胞株后细胞各周期的变化及细胞分布情况。结果显示S(MeO)TLC抑制吉西他滨耐药膀胱癌细胞RT1 12-Gr的体外增殖并诱导细胞凋亡,其机制是通过抑制细胞有丝分裂,将增殖的吉西他滨耐药膀胱癌细胞停滞在有丝分裂期(形成G2/M峰),导致细胞有丝分裂停滞形成单极纺锤体细胞,进而同时激活内源性和外源性Caspase依赖性凋亡途径诱导细胞发生凋亡。(5)体内试验结果表明与吉西他滨组及对照组相比,S(MeO)TLC及 S(MeO)TLC+吉西他滨腹腔注射均能有效地抑制吉西他滨耐药膀胱癌细胞皮下肿瘤的生长(尸<0.05),上述两组肿瘤均出现明显坏死。结论(1)膀胱癌组织、膀胱癌细胞及吉西他滨耐药膀胱癌细胞中均存在RRM1和RRM2蛋白的表达,RRM1和RRM2基因可能参与了吉西他滨化疗耐药的发生和发展。(2) RRM1和PRRM2高表达的膀胱癌患者术后的预后较差,主要表现为患者的无复发生存期较短。RRM1和RRM2表达水平是预测膀胱癌患者术后早期复发的独立预后因素。因此,对RRM1和RRM2高表达膀胱癌患者术后,建议给予更加积极的治疗方案。(3) RRM1、RRM2与Eg5 (KIF-11)存在基因共表达的现象。(4)体外实验证实Eg5蛋白靶向抑制齐S(MeO)TLC可以通过诱导吉西他滨耐药膀胱癌细胞有丝分裂停滞抑制细胞生长,并诱导细胞经内源性和外源性Caspase依赖性途径凋亡,疗效显著。(5)腹腔注射S(MeO)TLC能安全有效地抑制吉西他滨耐药膀胱癌皮下肿瘤模型的生长。创新及意义(1)国内外首次研究了RRM1和RRM2蛋白表达水平与膀胱癌生物学行为及术后预后之间关系,为膀胱癌预后判断提供依据。(2)国内外首次证实了RRM1和RRM2可以作为吉西他滨耐药膀胱癌预后预测的分子标记物。(3)国内外首次研究了Eg5抑制齐S(MeO)TLC治疗吉西他滨耐药膀胱癌的抗癌疗效及作用机制,为膀胱癌晚期化疗耐药提供创新性的靶向化疗方案。