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第一部分葛根总黄酮体外调控NB4细胞凋亡及自噬的实验研究研究目的葛根总黄酮(PRF)是中药葛根的总黄酮提取物,课题组前期研究证实PRF对多种白血病细胞株有增殖抑制和诱导凋亡的作用,可能与JNK活化有关,其中以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞最为明显。因此,本研究进一步以NB4细胞为研究对象,探讨较低浓度PRF诱导NB4细胞凋亡抑或自噬的作用及可能的分子机制。实验方法1.0、10、30、50μg/mlPRF体外作用于NB4细胞24,48,72h,MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期,凋亡率及线粒体膜电位等。2.0、10、30、50μg/ml lRF体外作用于NB4细胞48h,western blot检测细胞凋亡相关的蛋白caspase-9,cleaved-PARP,cleaved-caspase-3,MAPKs家族蛋白中p38,ERK和JNK,以及JNK通路磷酸化蛋白p-JNK,p-c-Jun,p-MKK4,自噬相关蛋白p62,Beclinl和LC3等蛋白表达。3.30μg/ml PRF分别联合自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂雷帕霉素,western blot检测凋亡蛋白PARP和cleaved caspase-3的表达。4.0、1、5、10μg/ml PRF体外作用于NB4细胞48h,FCM检测细胞表面标记CD33,CD15和CD11b的表达。结果1.MTT结果显示10、30、50μg/ml PRF显著抑制NB4细胞增殖,呈明显的时间、浓度依赖性,48h增殖抑制率分别是42.12%±4.20%,66.79%±6.23%,82.09%±2.3 6%。2.FCM结果显示0、10、30、5μg/ml PRF处理48h引起NB4细胞凋亡率分别为6.81%,9.27%,14.74%和31.91%,呈浓度依赖性增加;线粒体膜电位的检测,显示各组JC-1聚合体分别为94.25%,88.41%,78.77%和61.10%,而各组JC-1单体分别为5.75%,11.59%,21.08%和38.87%。3.FCM检测细胞周期显示G1期比例增加,10、30、50μg/ml PRF分别是46.47%,53.05%和60.81%,而G2期比例降低,分别是21.90%,15.55%和9.71%。4.Western blot法对凋亡标志蛋白的检测发现PRF上调caspase-9,cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表达,对Bc12家族蛋白的检测显示抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达上调;检测MAPKs家族蛋白发现PRF对p38和ERK表达没有明显影响,但下调JNK蛋白表达,继而检测JNK通路的磷酸化表达显示PRF引起p-JNK,p-c-Jun和p-MKK4表达上调。5.Western blot法检测自噬相关蛋白的表达发现10、30、50μg/ml PRF引起NB4细胞的Beclinl和LC3 II表达上调,而p62表达下调。进一步采用30μg/ml PRF分别联合自噬抑制剂3-MA或自噬激动剂雷帕霉素,发现联合3-MA组cleaved-PARP和cleaved caspase-3较单药组表达增加,而联合雷帕霉素组表达降低。6.采用FCM对细胞表面抗原的分析显示,更低浓度(1、5、10μg/ml)PRF能增加NB4细胞表面CD11b和CD15的表达,降低CD33表达阳性率。结论10-50μg/ml PRF能有效抑制NB4细胞增殖,阻滞细胞周期于G1期,诱导细胞凋亡;PRF诱导NB4细胞凋亡过程伴有线粒体膜电位降低,p-JNK、p-MKK4和p-c-Jun蛋白上调。同时PRF诱导NB4细胞凋亡过程中伴有自噬水平升高,检测到LC3 II表达上调且p62表达下调,分别联合3-MA或雷帕霉素结果提示PRF作用NB4细胞引起自噬水平升高起抗凋亡作用;1、5、10μg/mlPRF还能一定程度诱导NB4细胞向成熟粒细胞分化。第二部分青蒿琥酯体外抗NB4,HL-60及NB4-R1细胞的实验研究研究目的青蒿琥酯(ART)是青蒿素的半合成衍生物,对多种血液肿瘤表现出抗肿瘤效应。本研究拟探讨ART对NB4,HL-60和NB4-R1细胞的作用和可能机制。实验方法1.0、2、10、20μg/mlART体外处理NB4,HL-60和NB4-R1细胞12、24、48h,MTT检测细胞增殖抑制率。2.0、2、10、20μg/ml ART体外处理NB4,HL-60和NB4-R1 细胞24h,TUNEL染色观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡率。3.0、2、10、20μg/ml ART体外处理NB4,HL-60和NB4-R1 细胞24h,western blot检测凋亡相关蛋白caspase-9,caspase-3,PARP,自噬相关蛋白p62,Beclin1,MAPKs 家族蛋白 p-p38,p-ERK,p-JNK,JNK,p-ATF-2,p-MKK4,PI3K/AKT/mTOR通路蛋白p-AKT,p-mTOR,FOX03a,内质网应激蛋白IRE1α的表达。结果1.MTT结果显示2、10、20μg/ml ART作用NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞系12、24、48h后,细胞增殖显著受抑,且与时间、浓度呈正比。2.采用TUNEL染色观察1Oμg/ml ART处理48h后,与空白对照组相比,NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞均表现出明显的TUNEL阳性率增高。3.FCM检测细胞凋亡率显示2、10、20μg/mlART能明显增加NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞的凋亡率,NB4各组凋亡率分别为5.09%、13.81%、33.71%,NB4-R1分别为9.06%、14.75%、29.59%,HL-60分别为12.18%、23.91%、53.28%呈明显的浓度依赖性。4.Westemblot结果显示2、10、20μg/mlART对NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞都有上调cleaved caspase-3,cleaved PRAP和caspase-9表达的作用,并下调pro-caspase-3表达。5.对MAPKs家族蛋白的检测发现2、10、20μg/mlART在这三个细胞系中都能引起p-JNK,p-ATF-2和p-MKK4表达增加,JNK表达降低。不同的是ART在NB4细胞中对p-p38和p-ERK表达没有明显影响,但在HL-60和NB4-R1细胞中上调p-p38和p-ERK的表达。6.Western blot检测PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达显示2、1 0、20μg/ml ART抑制了三种细胞的p-AKT和p-mTOR的表达,并引起FOX03a表达增加。7.Western blot检测p62和LC3 Ⅱ表达和内质网应激蛋白显示2、10、20μμg/ml ART在NB4和HL-60细胞中引起IRE1α以及p62和LC3Ⅱ同时表达上调,但在NB4-R1细胞中未见此变化。结论2、10、20μg/mlART能有效抑制NB4,HL-60和NB4-R1细胞增殖,诱导凋亡发生,其过程伴有p-JNK、p-ATF-2和p-MKK4表达上调,抑制p-AKT、p-mTOR表达,上调FOXO3a表达有关。ART在NB4和HL-60细胞还能引起LC3Ⅱ和p62以及内质网应激蛋白表达上调,而在NB4-R1细胞并未发现类似改变,是否与维甲酸耐药相关有待进一步研究证实。