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研究背景及目的卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,早期症状隐匿难以察觉,多半患者察觉时已是晚期,并且缺乏有效的诊疗方法,致死率位于妇科恶性肿瘤之首。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)是最常见的卵巢恶性肿瘤,约占85%～90%。高级别浆液性卵巢癌(High-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是EOC中恶性程度最高的一种,侵袭性强,预后差,其发病率居于卵巢恶性肿瘤首位。HGSOC严重危害女性健康,其早期诊断和治疗是目前全球面临的难题。Kallistatin是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员,有研究表明Kallistatin在多种恶性肿瘤中表达降低,并在血管生成、炎症、肿瘤发展和转移等多方面发挥着重要作用。然而,Kallistatin在HGSOC中的表达和生物学作用尚不清楚。该课题探究了 Kallistatin在HGSOC中的表达以及与临床病理各项指征之间的相关性,通过上调或者下调Kallistatin研究其在HGSOC发生发展过程中生物学作用及其机制,探索其作为HGSOC的预后标记物和治疗靶点的可能性,并为HGSOC化疗耐药提供了新的思路。研究方法通过实时定量PCR(RT-qPCR)及免疫印迹实验(Western blot,WB)检测Kallistatin在正常输卵管伞(Fimbriae tube,FT)和HGSOC组织中的表达差异。利用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)在组织芯片中验证Kallistatin在正常FT和HGSOC组织中的表达差异,以及与HGSOC预后和各临床病理特征之间的关系。构建Kallistatin过表达质粒,利用慢病毒感染卵巢癌细胞建立过表达细胞系;利用Kallistatin小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)下调细胞中Kallistatin的表达。通过MTT实验、克隆形成实验、流式检测周期实验和裸鼠皮下成瘤实验,验证Kallistatin对卵巢癌细胞增殖能力的影响。利用Transwell实验验证Kallistatin对卵巢癌细胞侵袭迁移的影响,WB检测上皮间质转化(Epithelial—mesenchymal transition,EMT)有关蛋白的变化情况。将一定浓度梯度的顺铂作用于卵巢癌细胞,通过WB、MTT、克隆形成和凋亡分析Kallistatin对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。WB检测Kallistatin对Wnt-β-catenin信号通路的影响。研究结果1.WB结果显示Kallistatin在HGSOC组织中的蛋白表达水平明显高于正常FT组织。qRT-PCR结果提示Kallistatin在HGSOC组织中的mRNA水平明显高于正常FT组织。组织芯片结果分析显示Kallistatin在正常FT中的高表达率为91.7%,而在HGSOC中的高表达率仅为34%。2.组织芯片结果分析表明Kallistatin低表达组的总生存期(Overall survival,OS)和无进展生存期(Progression-free survival,PFS)均短于高表达组。Kaplan-Meier Plotter网站分析进一步证实了 Kallistatin低表达的病人预后不良。多变量分析表明Kallistatin是影响OS的独立因素。Kallistatin的表达水平与腹水体积、复发以及铂类化疗耐药有关。3.过表达Kallistatin后,卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力明显降低,周期实验结果显示细胞阻滞在G0/G1期,S期减少,下调Kallistatin表达则会促进G1向S期转化,S期增加。裸鼠皮下成瘤模型结果显示,Kallistatin过表达组的种植瘤明显小于对照组。4.Transwell实验显示Kallistatin能显著抑制卵巢癌细胞从小室的上室穿越至下室,干扰后结果相反。WB检测上皮间质转化EMT通路相关分子发现,上调Kallistatin 后,间质性分子 N-cadherin、ZEB1 和 Slug 表达下降;干扰 Kallistatin后,N-cadherin、ZEB1 和 Slug 表达升高。5.WB显示Kallistatin在顺铂耐药株细胞A2780DDP中表达明显低于A2780;随着顺铂加药浓度的增加,卵巢癌细胞中的Kallistatin蛋白水平逐渐降低。顺铂杀伤实验显示Kallistatin过表达组的细胞生长抑制率明显高于对照组。克隆实验表明同等顺铂浓度作用相同作用时间后,Kallistatin过表达组的克隆形成能力明显减弱。流式结果显示顺铂作用相同时间后,Kallistatin过表达组的细胞凋亡比例明显增加。WB检测凋亡相关分子,结果显示上调Kallistatin后cleaved PARP、cleaved caspase-3和BAX表达均增加,下调Kallistatin后变化相反。6.WB显示过表达Kallistatin后,Wnt信号通路负调节因子APC表达增加,β-catenin和Wnt通路靶基因c-myc、CCND1表达减少。结论1.Kallistatin在HGSOC组织中普遍低表达,其低表达预示预后不良,并与腹水、铂类化疗耐药和肿瘤复发有关。2.Kallistatin可抑制卵巢癌细胞增殖和迁移侵袭能力,并通过促进凋亡增强顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用,提高化疗敏感性。3.Kallistatin可抑制Wnt-β-catenin信号通路激活,在卵巢癌中发挥着抑癌基因的作用。