碘乙酸对抗氧化酶的毒性效应与作用机制研究

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在饮用水消毒过程中,消毒剂会与水中的天然有机物发生反应生成消毒副产物(DBPs),对人体健康形成潜在危害。随着DBPs流行病学和毒理学研究的不断深入,人们对DBPs的健康风险也越来越重视。碘乙酸(IAA)是一种典型的DBPs,具有低剂量、高毒性的特点,尤其是在细胞毒性、遗传毒性和致畸性等方面均高于同类DBPs。因此,IAA在DBPs的毒性研究领域日益受到研究者们的关注。IAA的毒性作用机理十分复杂。在目前对IAA的毒理学研究中,已有研究资料证明,IAA诱发氧化应激对机体造成的氧化损伤是IAA毒性作用的重要机理之一。氧化应激是指机体内氧化和抗氧化系统失衡的状态。抗氧化酶作为抗氧化系统的重要组成,其主要作用就是清除机体内过剩的活性氧(ROS),维持氧化还原水平的平衡。分子水平的毒理学研究发现,小分子污染物进入机体后,可能通过与酶发生相互作用改变酶的分子结构,从而影响酶的功能。所以IAA可能通过与抗氧化酶发生相互作用,改变酶的结构和功能,导致ROS清除受到影响,从而诱发氧化应激。因此,本研究以小鼠原代肝细胞为细胞模型,探究IAA对细胞内两种抗氧化酶——过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。又以CAT和SOD为生物大分子模型,探究IAA与两种酶的相互作用机制,结合细胞水平和分子水平的研究阐述IAA对抗氧化酶的毒性效应与作用机制。研究的主要内容包括以下三个部分:(1)对饮用水消毒副产物IAA的毒性研究现状、氧化应激、IAA的毒性作用与氧化应激的关系进行了综述。明确了当前有关IAA毒性机理研究的不足之处,确定了本文的主要研究内容。(2)首先以小鼠原代肝细胞为细胞研究模型,在模拟生理环境的实验条件下,对细胞内CAT活性进行测定,从细胞水平研究IAA暴露对细胞CAT活性的影响。实验结果表明,随着IAA浓度的增加,细胞内CAT活性上升。然后以CAT分子为生物大分子研究模型,利用分子酶活性测定、等温滴定量热测定、紫外-可见吸收光谱等多种光谱测定以及分子模拟技术等方法,探究IAA与CAT的相互作用对CAT结构和功能的影响。研究结果表明,IAA暴露下抑制了分子CAT的活性。IAA在范德华力和氢键作用力驱动下与CAT进行结合,结合常数为(1.57±0.481)×10~3,结合位点个数大约为4个。与IAA的相互作用改变了CAT的二级结构,导致蛋白质骨架变得松散,使CAT聚集形成的蛋白质团聚体体积也发生了变化。当IAA与CAT进行结合时,首先会结合在CAT分子表面的结合位点上,该位点处的结合不会对CAT活性造成直接影响。当CAT表面位点的结合达到饱和后IAA会与CAT活性中心附近的位点结合,并与影响酶活性的关键氨基酸残基HIS 74和TYR 357相互作用,导致Heme基团周围结构发生变化,使氨基酸残基微环境极性增强,影响底物进入活性中心。综合细胞和分子实验结果,得出细胞CAT活性变化的原因如下:一方面是细胞的自我保护机制对IAA刺激做出的响应,使得CAT含量增加,促进了细胞CAT活性;另一方面是IAA引起CAT分子结构的变化以及与HIS 74和TYR 357的相互作用使分子酶活性受到抑制。(3)首先以小鼠原代肝细胞为细胞研究模型,在模拟生理环境的实验条件下,对细胞内SOD活性进行测定,从细胞水平研究IAA暴露对细胞SOD活性的影响。实验结果表明,细胞内SOD活性随着IAA浓度的增加而提高。然后以SOD分子为生物大分子研究模型,利用分子酶活性测定、等温滴定量热测定、紫外-可见吸收光谱等多种光谱测定、Zeta电位测定以及分子模拟技术等方法,探究IAA与SOD的相互作用对SOD结构和功能的影响。研究结果表明,在IAA暴露下分子SOD的活性得到了促进。IAA在静电力驱动下与SOD进行结合,结合位点数大约为7个,结合常数为(7.09±2.88)×10~2。在与IAA发生相互作用后,SOD构象发生了改变,主要体现在二级结构中α-螺旋和β-转角含量略微上升、β-折叠和无规则卷曲含量略微下降,导致了肽链的错误折叠以及使蛋白质骨架变得松散。除此之外,SOD的内源性荧光被猝灭,导致酪氨酸残基的微环境发生变化。IAA在与SOD结合时会优先结合在SOD活性中心附近的结合位点上,这个结合会改变位点周围的分子结构。综合细胞和分子实验结果得出细胞SOD活性变化的原因如下:一方面是细胞为消除IAA诱发氧化应激产生的ROS,生成SOD的量增加;另一方面是与IAA的相互作用使SOD分子空间结构发生变化,分子酶活性升高。
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