研究背景：结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，2000年世界癌症流行趋势分析表明，全球结、直肠癌发病率居恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位。近些年来我国大肠癌发病率的上升趋势亦十分明显。其中城市结肠癌的发病率以4％的年增长率递增，而男性结肠癌患者增加了58.8％。由于其临床表现常较隐匿且缺乏特异性，难以早期发现，大多数患者就诊时已属于中晚期，且结肠癌手术切除后转移或复发率高。化学治疗具有严重的毒副作用，如骨髓抑制，心、肝、肾等器官的损伤。手术切除是其重要的治疗手段，但中晚期患者术后转移或复发率高，化疗毒性反应大。因此需要寻求新的治疗方法。基因治疗是当前研究的热点，但面临载体安全性、靶向性差两大问题，临床使用受到限制。载体的问题是基因治疗的关键。许多的载体，病毒载体和非病毒载体以前已广泛应用，病毒载体主要包括腺病毒，逆转录病毒，腺相关病毒等；但病毒载体在安全性方面存在潜在的危险；免疫原性比较强，注射到机体后很快会被机体的免疫系统排斥，当静脉注射高浓度的腺病毒载体会使肝脏发生严重的炎症反应；非病毒载体目前常用的有脂质体及多聚阳离子聚合物；但脂质体和阳离子聚合物介导基因转移缺乏组织的特异性和靶向性，转染效率较低且易被网状内皮系统吞噬，基因表达时间短；因此研制新型的非病毒载体已成为研究的热点，纳米颗粒具有小尺寸效应，表面效应，随着颗粒直径变小，比表面积将会显著增大，故具有很高的化学活性，因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。研究表明，纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒，在短时间内，不会很快被吞噬细胞清除，从而更多的渗出到血管外，组织间隙，延长与细胞的接触时间，提高转染效率；通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解，但纳米基因载体有浓缩，保护DNA功能，与DNA形成一致密的结构，使DNA不被核酸酶消化降解。为了提高基因治疗载体的靶向性，降低对正常细胞的损伤，人们设计了很多方法，靶向性转录技术便是其中之一。靶向性转录技术是利用组织和细胞特异性启动子控制基因的转录，从而使治疗基因在特定的细胞中表达，达到靶向治疗的目的。癌胚抗原(CEA)是结肠癌等恶性肿瘤相对特异性标志物，在结肠癌中的阳性率约为70％-90％，在结肠癌肝转移及复发病例其阳性率更高，可作为结肠癌重要的监测指标，且癌胚抗原的肿瘤特异性也被许多肿瘤基因治疗所采用。CEA转录调控元件包括增强子元件和在5侧翼区域的启动子，这些元素能调控目的基因在癌胚抗原(CEA)为阳性的癌组织中表达，从而达到靶向治疗的目的。目的：本课题探讨由CEA启动子、CMV增强子组成的高活性嵌合启动子，通过融合启动子的调控提高融合自杀基因yCDglyTK在靶细胞表达的特异性；并以无毒副作用生物相容性好的磷酸钙纳米为载体，将该自杀基因靶向导入结肠癌细胞中，以达到提高基因治疗靶向性及安全性的目的。方法：本研究利用化学方法制备一种30nm大小、分散均匀的磷酸钙纳米颗粒，采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体，并以该纳米为载体将pcDNA3.1(-)CV·yCDglyTK质粒表达载体转染结肠癌lovo细胞系进行体外实验研究，荧光显微镜、流式细胞仪检测纳米的转染效率，分别用RT-PCR、Western-blot杂交等方法检测鉴定yCDglyTK融合自杀基因在lovo细胞内的表达；MTT法检测5-FC、GCV对野生型lovo细胞的毒性；MTT法、克隆形成实验检测自杀基因前药系统对表达自杀基因的lovo细胞的杀伤效应；绘制细胞生长曲线反映该系统对lovo细胞生长的影响；免疫组化及免疫荧光检测治疗前后自杀基因蛋白表达水平的变化；用高效液相色谱(HPLC)法测定处理前后前体药物5-FC向5-FU转化效率的变化；用pcDNA3.1(-)CV·yCDglyTK阳性克隆细胞移植Balb／C裸鼠进行肿瘤治疗的体内试验。结果：在经不同浓度的氯化钙等试剂修饰后，磷酸钙纳米颗粒能与质粒DNA有效结合，通过复合体吸附在细胞膜上并进入细胞内，增加进入细胞内DNA量，提高基因转染的效率，并且质粒DNA与纳米颗粒形成的复合体能有效的抵抗血清中酶类对DNA分子的降解，有效的保护DNA分子的完整性；用绿色荧光蛋白(GFP)基因作报告基因，与磷酸钙纳米颗粒结合后转染常规培养的lovo细胞，用荧光显微镜及流式细胞仪检测，发现该纳米具有较高的转染效率；5-FC和GCV在高浓度(5-FC＞200ug／ml，GCV＞50 ug／ml)时，对野生型Lovo细胞亦有一定的杀伤作用；对于yCDglyTK阳性lovo细胞，当5-FC的浓度为10ug／ml和200ug／ml时，细胞存活率分别是63.23％和11.02％；同时，结果显示，yCDglyTK阳性lovo细胞在两种前体药物5-FC和GCV同时存在的条件下，并没有大多数文献报告的显示出协同杀瘤作用，其作用反而低于单独使用5-FC；200ug／ml5-FC处理yCDglyTK阳性lovo细胞24小时后，用高效液相色谱法测定细胞上清中5-FU浓度是168ug／ml，5-FC向5-FU转化效率是84％；旁杀效应实验显示，在200 ug／ml 5-FC存在时，只要pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK质粒有20％的转染效率，细胞的相对存活率将下降为32.6％，说明该融合自杀基因前药系统具有有强大的“旁杀效应”；动物试验中，CVyCDglyTK+5-FC组的肿瘤与CPNP-CVyCD-glyTK+5-FC组、CPNP-CMVyCDglyTK+5-FC组有显著性差异(P＜0.05)，与yCDglyTK+PBS及Lovo+5-FC组有极显著性差异(P＜0.01)。这说明纳米介导的自杀基因前药治疗均有明显的抑瘤作用。结论：1)磷酸钙纳米粒能有效介导pcDNA3.1(-)CV·yCDglyTK自杀基因质粒载体转染lovo细胞，且未显示明显毒副作用，因此该纳米可能成为一种新型的用于基因治疗的非病毒载体。2)5-FC与GCV对yCDglyTK阳性细胞均有明显杀伤作用，但二者无协同作用，其作用弱于单独5-FC而强于GCV。3)该融合自杀基因前药系统具有有强大的“旁杀效应”4)该融合自杀基因前药系统，当前体药物浓度5-FC<200 ug／ml，GCV<50ug／ml，在此浓度下，对不含自杀基因的lovo细胞毒性很低。5)体外与体内实验结果均显示，以磷酸钙纳米为载体介导CEA调控下的自杀基因在肿瘤的治疗中显示良好的靶向杀伤效应。