研究背景皮肤病病种繁多,目前已知的皮肤病约有2000-3000种,危及生命的仅占2%,而天疱疮（pemphigus）是这些为数不多的危及生命的皮肤病中的一种。天疱疮是一种自身免疫性疾病,发病机制尚不完全明确,目前主流观点认为其发病与自身抗体的产生相关,主要发病年龄在50-60岁,男女发病率相近,以皮肤、黏膜的水疱、大疱为主要特征[1]。因皮肤屏障的破坏,患者感染几率大大上升;同时皮肤及黏膜的糜烂,导致患者瘙痒、疼痛,饮食、睡眠等日常生活能力受到限制,生活质量短时间内急剧下降。因而,天疱疮的早期诊断和及时的治疗十分重要。大疱性疾病分为许多种,如天疱疮、副肿瘤性天疱疮（paraneoplastic pemphigus,PNP）,慢性家族性良性天疱疮（hailey hailey disease,HHD）、大疱性类天疱疮（bullous pemphigoid,BP）、瘢痕性类天疱疮、疱疹样皮炎、线状IgA大疱皮病、获得性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa acquisita,EBA）、营养不良性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa dystrophica,EBD）等等,因疾病种类不同,治疗方法及重点亦有区别。由于类天疱疮发病率较高且与天疱疮患者发病年龄相仿,天疱疮常需与类天疱疮鉴别。目前天疱疮仍以临床表现结合组织病理、免疫诊断为其主要诊断标准。传统的诊断方法过程繁琐,历时较长,不利于临床的诊断和治疗,因而亟待新的准确而迅速的生物诊断指标为其早期诊断指引方向。microRNA（miRNA）是一种核小RNA,在调控皮肤病的多种因子中,是非常重要的一种。它参与基因的转录和表达,调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等多种生物功能。已有研究证实,miRNA的异常表达与包括系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、多发性硬化症（systemic sclerosis,SS）、类风湿性关节炎（rehumatic arthritis,RA）、银屑病等多种自身免疫性疾病存在相关性[2]。目前已有的关于miR-338-3p的研究主要集中于肿瘤性的疾病,它可能是作为一种肿瘤抑制因子而发挥调控作用。在肿瘤组织中miR-338-3p表达水平明显降低,相反,人为的上调miR-338-3p的表达后可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和促进肿瘤细胞的凋亡[3,4]。然而,在非肿瘤性疾病的细胞和组织中,miR-338-3p表达水平的变化及其可能对于细胞的作用仍然少有研究。本课题组前期以基因芯片的方式对天疱疮患者PBMC中miRNAs进行分析,发现天疱疮患者miR-338-3p的表达水平明显上调,提示miR-338-3p在天疱疮患者中可能存在一定的调控功能并存在潜在的生物学诊断价值。本研究拟通过分离活动性天疱疮患者、非活动性天疱疮患者、活动性大疱性类天疱疮患者的外周血单个核细胞（peripheral blood molecular cell,PBMC）,通过荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-338-3p的表达。对入组的接受治疗的天疱疮患者进行至少为期2周的随访,监测治疗过程中PBMC中miR-338-3p表达水平的变化。分离健康受试者原代PBMC,通过细胞转染上调miR-338-3p的表达,筛选miR-338-3p的可能靶基因并对其功能学进行研究。目的1.验证活动性天疱疮患者中miR-338-3p的表达水平是否上调,其表达水平在健康受试者、活动性天疱疮患者、非活动性天疱疮患者和活动性大疱性类天疱疮患者中是否有差异。2.检测miR-338-3p在天疱疮治疗过程中表达水平的变化,探讨miR-338-3p的表达与天疱疮的病情活动程度的相关性,对治疗效果评价的有效性。3.筛选miR-338-3p的可能靶基因并进行功能学研究。方法1.在南方医科大学南方医院皮肤科门诊及病房收集活动性天疱疮患者、非活动性天疱疮患者、活动性大疱性类天疱疮患者的血标本,在南方医科大学南方医院健康管理中心收集健康受试者的血标本,分离其外周血PBMC并通RT-qPCR得到其中miR-338-3p的表达情况,比较不同组别间miR-338-3p表达水平的变化。收集所有入组天疱疮患者的基本信息,进行PDAI、ABSIS评分,根据初发/复发,疾病严重程度,性别等分组,分析miR-338-3p表达水平的变化。2.对入组的接受治疗的活动性天疱疮患者进行为期至少2周的随访,收集天疱疮患者治疗前后临床检验检查信息,定期进行PDAI、ABSIS评分,监测患者治疗前后血清天疱疮抗体水平及PBMC中miR-338-3p表达水平的变化。结合天疱疮患者临床检验检查结果、患者基本信息、miRNA表达水平的变化、疾病严重程度的评分等,评估miR-338-3p和天疱疮抗体水平与疾病活动程度的相关性。3.分离健康受试者外周血原代PBMC,通过细胞转染上调PBMC中miR-338-3p的表达水平,筛选其可能的靶基因,进行PCR、蛋白质水平的验证并完善荧光素酶确认其相互作用。统计学分析分析所得数据所用的软件为SPSS 20.0软件,其中计量资料用均数±标准（x±SD）差显示,计数资料用频数及频率（n,%）表示。统计方法包括两独立样本t检验,配对样本t检验,单因素方差分析（analysis of variance,ANOVA）,重复测量数据的方差分析,受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,卡方检验,Fisher确切概率法,广义估计方程等。RT-qPCR数据通过2—△△CT计算得到（△CT值=目标基因CT值-内参基因CT值;△△CT值=实验组△CT值-对照组△CT值）,通过比较各组2—△△CT值得出结论。p值小于0.05（p＜0.05）时差异有统计学意义。结果:1.活动性天疱疮患者PBMC中miR-338-3p表达量较健康受试者、非活动性天疱疮患者、活动性大疱性类天疱疮患者的表达水平明显升高。在活动性天疱疮患者中miR-338-3p表达情况与病情严重程度、初发/复发状态、性别等无明显关系。2.活动性天疱疮患者接受治疗后miR-338-3p表达量随病情的好转而下降。比较治疗前和治疗后2周、治疗后6周miR-338-3p的情况,治疗后2周及6周的表达水平明显低于治疗前。治疗后2周及6周天疱疮抗体（抗Dsg-1、Dsg-3抗体）表达水平与治疗前无明显变化。在矫正患者基线特征和其他临床指标后发现,miR-338-3p的表达水平与疾病严重程度显著相关。3.筛选miR-338-3p的靶基因:（1）成功分离健康受试者外周血单个核细胞,为椭圆形细胞,悬浮生长。（2）在健康受试者的PBMC中上调miR-338-3p的表达水平可导致RNF114 mRNA表达水平和RNF114蛋白表达水平的下调。（3）荧光素酶报告基因结果:野生型RNF114的3’UTR（Untranslated Regions）可与 miR-338-3p 结合,RNF114 在是 miR-338-3p 的靶基因。（4）在天疱疮患者中的PBMC中RNF114 mRNA和蛋白表达水平上调。结论1.与健康受试者相比,miR-338-3p在活动性天疱疮患者中表达水平明显升高且在非活动性天疱疮患者和活动性类天疱疮患者中不升高。ROC曲线中曲线下面积（area uner the cureve,AUC）=0.8919,提示 miR-338-3p 可以作为天疱疮活动及诊断的生物指标。2.miR-338-3p的表达水平与患者病情缓解程度相关,其表达水平随着病情的缓解而下降。miR-338-3p的变化较天疱疮抗体更为敏感,可以作为天疱疮病情活动程度的监测指标。3.RNF114是miR-338-3p的靶基因。天疱疮患者中RNF114的高表达可能是由于自身免疫状态,天疱疮患者中RNF114原发性的高表达,促进T细胞活化及自身抗体的产生。由于miR-338-3p能与RNF114结合并诱导其降解,因而,天疱疮患者中miR-338-3p反馈性上升。