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本实验室前期利用连续传代的方法获得了来自瘤胃的厌氧真菌和甲烷菌的富集培养物,并发现厌氧真菌和甲烷菌可以在体外长期稳定共存;本实验室前期还从不同草食动物肠道及粪便分离得到了多个厌氧真菌和甲烷菌的共培养,并发现共培养降解一系列粗纤维的能力显著高于厌氧真菌纯培养。然而,在厌氧真菌和甲烷菌富集培养物中,厌氧真菌和甲烷菌之间的紧密关系是否存在种属特异性,目前并不是很清楚。此外,甲烷菌共存时厌氧真菌的代谢以及甲烷菌促进厌氧真菌降解和利用一系列底物的机制并不明了。因此,本论文首先以厌氧真菌和甲烷菌富集培养物为研究对象,揭示其代谢粗纤维的特性以及厌氧真菌和甲烷菌共发生的种属特异性;接着选取典型的厌氧真菌和甲烷菌共培养菌株,探究甲烷菌共存时厌氧真菌的代谢以及甲烷菌促进厌氧真菌利用底物的机制。1 瘤胃厌氧真菌与甲烷菌富集培养物和瘤胃细菌与甲烷菌富集培养物发酵秸秆特性的研究以稻秸或麦秸为底物,将瘤胃内容物分别接种于含青链霉素(FM组,厌氧真菌和甲烷菌富集培养物)、含放线菌酮(BM组,细菌和甲烷菌富集培养物)以及不含抗生素(RC组)的培养基中,于39℃体外发酵70 h。测定发酵不同时间点的产气量和甲烷产量;发酵结束后测定pH值、体外降解率、发酵代谢产物以及微生物的数量。各处理组降解稻秸存在如下顺序:RC组>FM组>BM组。各处理组降解麦秸存在如下顺序:FM组>RC组>BM组。以稻秸及麦秸为底物进行发酵时,FM组的pH值显著低于RC组和BM组(P<0.05);FM组总产气量与RC组均无显著差异(P>0.05),且显著高于BM组(P<0.05);FM组甲烷产量显著高于RC组和BM组(P<0.05);FM组总VFA浓度在三个处理组中最低,然而乙酸浓度显著高于RC组和BM组(P<0.05),无丙酸、戊酸、异丁酸和异戊酸的产生;FM组甲酸的浓度显著高于其它两组(P<0.05),然而氨氮的浓度显著低于其它两组(P<0.05)。以稻秸或麦秸为底物进行发酵,FM组厌氧真菌的数量显著高于RC组和BM组(P<0.05),然而其细菌的数量则显著低于其它两组(P<0.05);FM组古菌的数量最高,显著高于BM组(P<0.05);BM组厌氧真菌的数量最低,显著低于RC组和FM组(P<0.05),然而其细菌数量则最高,显著高于FM组(P<0.05)。结果表明:厌氧真菌-甲烷菌富集培养物具有很强的粗纤维降解能力,其降解稻秸和麦秸的能力强于细菌-甲烷菌富集培养物;厌氧真菌-甲烷菌富集培养物具有很好的降解粗纤维产甲烷的能力。2 厌氧真菌和甲烷菌富集培养物中甲烷菌和厌氧真菌多样性以及两者共发生的研究本试验以第一章为基础,采集了甲烷菌和厌氧真菌富集培养物(FM)以及瘤胃内容物体系(RC)发酵稻秸和麦秸后的样品,提取DNA,对甲烷菌和厌氧真菌进行高通量测序,利用网络分析的方法研究甲烷菌和厌氧真菌共发生的种属特异性。结果显示,两种不同底物(稻秸和麦秸)对两体系中甲烷菌和厌氧真菌的多样性无显著影响(P>0.05)。Methanobtrevbacer是两体系中的优势甲烷菌属;Caecomyces则是优势厌氧真菌属。相比于RC组,FM组中甲烷菌和厌氧真菌的多样性降低。FM组中Methanobrevibacter和Methanosphaera的相对丰度显著高于RC组(P<0.05),而Group9、Group10和Group8的相对丰度则显著低于RC组(P<0.05)。FM组中Caecomyces的相对丰度显著高于RC组(P<0.05),而Piromyces、Orpinomyces和Neocallimastix的相对丰度则显著低于RC组(P<0.05)。相比于RC组,FM组中Methanobrevibacter与厌氧真菌的共发生关系得到加强,而Methanomassiliicoccales与厌氧真菌的共发生关系则减弱。上述结果表明,甲烷菌和厌氧真菌之间存在着紧密的互作关系,而Methanobrevibacter是与厌氧真菌关系最为密切的甲烷菌属。3 共存甲烷菌影响厌氧真菌对真菌抑制剂硝呋烯腙响应的研究以稻秸为底物,厌氧真菌纯培养和厌氧真菌-甲烷菌共培养为接种物进行体外发酵。两培养物中各添加不同浓度的硝呋烯腙(终浓度为0,5,10,25mg/L),于39℃培养箱中静置培养96h。在特定时间点测定产气量和甲烷含量;发酵结束后立即测定pH;剩余底物用于测定体外降解率;上清液用于代谢产物浓度的测定。相比于未添加硝呋烯腙纯培养组,5,10,25 mg/L硝呋烯腙纯培养组发酵稻秸的活性被显著抑制(P<0.05)。相比于未添加硝呋烯腙共培养组,5 mg/L硝呋烯腙共培养组发酵稻秸的活性并未显著降低:两者pH、产气量、甲烷产量、底物降解率以及乙酸浓度皆无显著差异(P<0.05)。然而10和25 mg/L硝呋烯腙共培养组发酵稻秸的活性则显著降低(P<0.05)。5,10 mg/L硝呋烯腙共培养组发酵稻秸的活性分别显著高于5,10 mg/L硝呋烯腙纯培养组(P<0.05)。当厌氧真菌被抑制后甲烷菌的生长也受到影响。上述结果表明,厌氧真菌和甲烷菌之间存在着互利共生的关系,厌氧真菌为甲烷菌提供底物,维持甲烷菌的生长;甲烷菌的存在则可以促进厌氧真菌对底物的降解。4 以单糖为碳源研究甲烷菌共存对厌氧真菌代谢的影响接种10 mL已生长三天的培养物悬浮液于预热至39℃的90mL培养基中(以葡萄糖或木糖为碳源),39℃静置培养96h。于发酵特定时间点测定产气量、氢气和甲烷产量。在0、24、48、72及96 h五个时间点终止一批发酵,测定pH值、底物浓度、菌体重量以及水溶性代谢产物。试验结果以葡萄糖和木糖两部分呈现。当以葡萄糖为底物进行发酵时得到如下结果:纯培养发酵葡萄糖的代谢产物主要为H2、甲酸、乙酸、乳酸和乙醇;共培养发酵葡萄糖的代谢产物主要为CH4、乙酸、乳酸和乙醇;甲烷菌共存缩短了厌氧真菌的生长延滞期;共培养组的葡萄糖最大消失率和最大细胞干重出现在发酵24h,而纯培养组则出现在48h;在共培养中,氢气在整个发酵期间都处于一个较低水平,甲酸虽然在24h存在大量积累,然而在48h则没有甲酸积累,pH则较24 h升高;共培养组24 h的苹果酸和乳酸浓度显著高于纯培养组(P<0.05),在48、72及96 h则显著低于纯培养组(P<0.05);共培养组乙酸的浓度在整个发酵期间显著高于纯培养组(P<0.05)。当以木糖为底物进行发酵时得到如下结果:纯培养发酵木糖的代谢产物主要为H2、甲酸、乙酸、乳酸和乙醇;共培养发酵木糖的代谢产物主要为CH4、乙酸、乳酸和乙醇;在48 h前,共培养和纯培养的产气量、pH和代谢产物(除甲酸)无显著差异(P>0.05),在48h后,共培养中积累的甲酸被甲烷菌大量利用,这导致共培养中的乙酸、C02和pH显著增加(P<0.05),乳酸和苹果酸则显著降低(P<0.05);共培养和纯培养对木糖的利用没有显著差异(P>0.05),然而共培养的氢化酶体代谢的碳源比例显著高于纯培养(P<0.05)。综上所述,厌氧真菌利用葡萄糖和木糖具有类似的代谢产物谱,厌氧真菌和甲烷菌共培养利用葡萄糖和木糖也具有类似的代谢产物谱。当以葡萄糖为底物进行发酵时,共存甲烷菌对厌氧真菌的促进作用主要为1)促进厌氧真菌对葡萄糖的吸收或转运2)增强厌氧真菌氢化酶体的能量代谢;当以木糖为底物进行发酵时,共存甲烷菌对厌氧真菌的促进作用主要表现在增强厌氧真菌氢化酶体的能量代谢。5 共存甲烷菌影响厌氧真菌代谢葡萄糖分子机制的研究以葡萄糖为底物,接种10 mL已生长三天的培养物悬浮液于预热至39℃的90 mL培养基中,39℃静置培养。于发酵特定时间点测定产气量、氢气和甲烷。在纯培养发酵中点(51h)和终点(80h),共培养发酵中点(36h)和终点(66h),四个时间点各终止一批发酵,取上清液测定其pH、葡萄糖、氨氮、蛋白浓度和水溶性代谢产物,菌体用于微生物定量以及转录组测序。结果显示,共培养发酵中点与纯培养发酵中点的产气量无显著差异(P>0.05),共培养发酵终点的产气量显著高于纯培养发酵终点的产气量(P<0.05)。共培养利用葡萄糖的速率高于纯培养:共培养发酵36 h和66h利用的葡萄糖分别与纯培养发酵51 h和80 h利用的葡萄糖无显著差异(P>0.05)。共培养中点组(C中点)的甲酸和乳酸显著低于纯培养中点组(M中点)(P<0.05),C中点组乙酸有高于M中点组的趋势(P=0.054)。共培养终点组(C终点)中未检测到甲酸,C终点组的乳酸显著低于纯培养终点组(M终点)(P<0.05),而C终点组乙酸则显著高于M终点组(P<0.05)。转录组测序发现,厌氧真菌F1在以葡萄糖为底物进行生长时表达大量粗纤维降解酶基因的转录本。在纯培养和共培养组中,相比于发酵中期,发酵末期许多与粗纤维降解酶相关的基因显著上调;大部分与胞内碳水化合物代谢相关的转录本则显著下调。比较C中点和M中点的转录本发现,甲烷菌共存显著上调了厌氧真菌糖转运体基因和己糖激酶基因的表达。以上结果表明,甲烷菌共存可能通过促进葡萄糖的转运,胞内葡萄糖的磷酸化以及氢体的代谢来促进厌氧真菌对葡萄糖的利用。综上所述,厌氧真菌和甲烷菌富集培养物具有很好的降解粗纤维产甲烷的能力,在这个系统中甲烷短杆菌是与厌氧真菌互作关系最为紧密的甲烷菌属。厌氧真菌和甲烷菌存在互利共生的关系:厌氧真菌为甲烷菌提供底物;甲烷菌通过利用厌氧真菌的代谢产物,消除产物抑制作用,增强厌氧真菌氢化酶体能量的代谢,进而促进厌氧真菌对底物的降解和利用。