论文部分内容阅读
近年来,血栓性疾病严重影响着人类的健康生活,且发病率和死亡率逐年增高,导致患者对溶栓药物的需求不断增加。然而,市售的溶栓药物种类较少、特异性差、作用时间短、溶栓能力弱、具有副作用,且价格昂贵。因此,寻找或研制高效、低毒、药效快、特异性高及价廉的溶栓化合物将会对人类健康产生重要意义。本研究对从植物体内分离出的高产纤溶酶的菌株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)及其代谢产生的纤溶酶进行了研究。(1)从山西黄河边、绍兴、长白山等地区采集的245份植物标本分离获得植物内生菌480株。利用脱脂奶粉-琼脂糖平板法从中初步筛选出64株具有分泌胞外蛋白酶能力的菌株。利用纤维蛋白-琼脂糖平板法复筛获得8株分泌纤溶酶的菌株。其中菌株HS-387产酶活力较高,可达266.58U/m L(相当尿激酶酶活力)。该菌株经形态学及分子生物学鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。(2)分析发酵条件对菌株HS-387分泌纤溶酶活性的影响,结果显示其最佳发酵条件为培养液装液量为100m L(250m L锥形瓶),培养液(灭菌前)p H值为4.0,真菌接种量为3.0×106CFU,放置28℃,175rpm,培养7天。优化后产生的酶活力为707.97U/m L(相当尿激酶酶活力),最终酶活力增到2.66倍。(3)将硫酸铵分级沉淀、DEAE-弱阴离子交换层析、SP-弱阳离子交换层析、丁基疏水层析等方法相结合,分离、纯化获得经Native-PAGE凝胶电泳验证纯度较高(96%以上)的纤溶酶,纯化后酶活力回收率为37.2%,最终该酶的比活力为6461.75U/mg(以尿激酶为标准)。并对获得的纯度较高的纤溶酶进行QE质谱鉴定、分析。(4)该菌株产生的纤溶酶等电点约为6.6,分子量约为45k Da,p H值5.0-9.0时该酶较稳定,p H3.0以下容易造成酶的失活。该酶在30℃-50℃时均具有较高酶活力,最适温度40℃。典型丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶的抑制率为60%,推测该酶可能为碱性丝氨酸蛋白酶。该酶水解纤维蛋白原的先后顺序是Aα链>Bβ链>γ链,对Aα链的降解最迅速;水解纤维蛋白的先后顺序是γ-γ链>α链>β链,对降解γ-γ链的作用较快。这类似于血纤维蛋白溶酶的水解模式,该酶不仅降解纤维蛋白,对于纤维蛋白的前体纤维蛋白原也有降解作用。研究表明其体外溶栓可能是通过直接降解纤维蛋白的方式发挥作用,不具有或仅有较小的激酶活性。综上所述,本研究从480株植物内生菌中分离筛选获得一株高产纤溶酶的菌株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus),目前尚未见有该菌种产生纤溶酶的报道。研究发现其产生的纤溶酶可能为碱性丝氨酸蛋白酶,对纤维蛋白和纤维蛋白原都具有降解作用,推测该酶在溶解血栓的同时还可以防止血栓的继续形成,从而为开发溶栓药物提供了一个潜在的新途径。