论文部分内容阅读
琥珀酸在医药、食品、化学等领域的应用十分广泛，潜在的市场需求量巨大。但是传统的石化法生产琥珀酸不但耗费大量非可再生资源，如石油等，而且生产过程污染环境。因此，需要探究一种生产琥珀酸的清洁方法。为了达到此目的，人们探究了以碳水化合物为碳源，利用微生物发酵法生产琥珀酸。目前，发酵法生产琥珀酸的研究已经有了初步发展，但是大多数的研究都是以葡萄糖为碳源，而对其他碳源的研究尤其是关于大肠杆菌利用木糖好氧发酵生产琥珀酸的报道较少。本论文研究大肠杆菌以木糖为碳源生产琥珀酸的方法，实现了不与人类争粮的资源战略思想，因此该方法具有潜在的市场前景。本实验目的是构建出木糖发酵生产琥珀酸的工程菌，为以木糖为原料发酵法生产琥珀酸做出实验室阶段的探究。本文利用途经分析的方法，以木糖为唯一碳源对大肠杆菌生物合成琥珀酸的代谢途径进行研究。根据途径分析的结果以大肠杆菌原始菌株BL21为出发菌株，利用一步敲除的方法进行菌种构建，利用PCR技术及琼脂糖凝胶电泳等方法验证基因是否敲除。将所构建的菌种进行摇瓶发酵，发酵结束后用HPLC对发酵液中的产物进行测定。通过本研究得出以下结论：(1)利用对细胞代谢结构的理解和基因组信息，建立了有氧条件下E.coli利用木糖生物合成琥珀酸的代谢途径模型。(2)对木糖生物合成琥珀酸的代谢途径进行了途径分析，确定了木糖生物合成琥珀酸的最佳代谢途径，计算最大理论转化率为0.83mol/mol木糖，确定了代谢途径改造策略，明确需要敲除的基因和需要过量表达的基因。(3)根据途径分析的结果，利用P1噬菌体一步敲除的方法敲除了大肠杆菌BL21菌株琥珀酸脱氢酶（SDH），磷酸转乙酰基酶（Pta），丙酮酸脱氢酶（PoxB）基因，构建基因工程菌ZXY542；敲除大肠杆菌BL21菌株琥珀酸脱氢酶（SDH），磷酸转乙酰基酶（Pta），丙酮酸脱氢酶（PoxB），异柠檬酸裂解酶阻遏物（IclR）基因，构建基因工程菌ZXY412；敲除大肠杆菌BL21菌株琥珀酸脱氢酶（SDH），磷酸转乙酰基酶（Pta），丙酮酸脱氢酶（PoxB），乙酸激酶（Ack）基因，构建基因工程菌ZXY354612。(4)根据途径分析的结果，过量表达大肠杆菌MG1655菌株磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，获得木糖生物合成琥珀酸的基因工程菌ZXY412-JL225-9，基因工程菌ZXY542-JL225-9，基因工程菌ZXY354612-JL225-9。(5)摇瓶发酵结果表明所构建的菌株都能够在好氧条件下利用木糖生物合成琥珀酸。