缓激肽(Bradykinin,BK)是由激肽释放酶原在激肽释放酶作用下被激活后生成的一种生物活性肽,它与其受体作用后可发挥多种生理功能,如扩张血管、降低外周血压、抑制平滑肌增殖等。缓激肽受体在动物体内分布广泛,几乎存在于所有组织中,主要有B1(B1 receptor,B1R)和B2(B2 receptor,B2R)两种亚型。在生理状态下,动物体内的缓激肽受体以B2R为主,但在应激状况(如缺血缺氧、炎症、外伤)下,B1R表达量明显增高。研究表明,B1R和B2R被激活后,在外周组织缺血缺氧性损伤中分别介导不同的作用,B1R激活表现为损伤加重,而B2R激活后表现为损伤减轻。本研究通过体外培养的神经元和星型胶质细胞,建立缺氧复氧模型,模拟在体缺血/再灌注过程,观察缓激肽受体在缺氧复氧损伤中的变化,应用B1R和B2R的特异性激动剂和抑制剂,探讨两种受体激活后在神经细胞缺氧复氧损伤中所介导的作用,并从信号转导通路的角度进一步探索其作用的深层机制。第一部分:缓激肽受体在体外培养神经元上的表达及缺氧复氧后表达的变化目的:研究缓激肽受体在体外培养的神经元上的表达及缺氧后不同时期表达的变化情况,是进一步探讨缓激肽受体在细胞缺氧后各时期作用的前提和基础。本文采用缺氧复氧模型,模拟体内缺血再灌注过程,缺氧90 min复氧4 h,观察缓激肽受体在神经元的表达及缺氧复氧后的变化情况。方法:采用免疫荧光双标的方法,观察缓激肽受体在神经元的分布;RT-PCR检测缺氧复氧不同时间B1R和B2R mRNA表达的变化;Western blot检测缺氧复氧不同时间B1R和B2R蛋白表达的变化。检测的时间点为:缺氧前、缺氧90 min、复氧1h、复氧4h、复氧12h、复氧24h。结果:1、在缺氧90 min,复氧4 h后,神经元胞体肿胀,MAP-2免疫荧光染色显示部分神经元轴突呈串珠样改变或断裂,MTT结果表明神经元存活率下降至正常培养状态下的50%左右。2、体外培养的神经元存在缓激肽B1R和B2R的表达,两者在细胞的分布存在差异,B1R主要分布于胞膜,B2R则主要分布于核膜。3、正常培养状态下的神经元B1R mRNA和蛋白表达量均很低,缺氧复氧可明显诱导B1R mRNA和蛋白的表达,复氧后1h左右达到高峰,之后迅速下降。正常培养状态的神经元有B2R mRNA和蛋白的表达,缺氧复氧使其表达量进一步增加,B2RmRNA表达水平在复氧后1h左右达到高峰,而B2R蛋白表达水平在复氧1-4h达峰,之后维持高表达。结论:1、缺氧模型有效,缺氧90 min复氧4 h可作为后续实验的干预时间点。2、在体外培养的神经元上存在缓激肽B1R和B2R的表达,两者在细胞分布以及缺氧复氧诱导的表达变化上存在差异,这可能是其介导不同生理作用的基础。第二部分:缓激肽受体激活在神经元缺氧复氧中的作用研究目的:探讨缓激肽B1R和B2R激活后在体外培养的神经元缺氧复氧损伤中所介导的作用。方法:应用缓激肽B1R和B2R特异性激动剂和抑制剂,对神经元进行干预,运用MTT法观察B1R和B2R被激活或抑制后神经元存活率的变化;LDH释放试验观察缓激肽B1R和B2R被激活或抑制后对神经元细胞毒性的影响;TUNEL法检测B1R和B2R被激活或抑制后对神经元凋亡的影响。结果:1、神经元缺氧90 min复氧4 h后存活率下降至缺氧前的50%左右,LDH释放显著增加,凋亡百分比也增加。2、应用缓激肽B1R激动剂des-Arg9-BK能够抑制缺氧复氧后神经元的存活,增加神经元的凋亡,细胞毒性作用亦增强。B1R激活对神经元的损伤作用可被B1R特异性的抑制剂Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所部分抑制。3、缓激肽B2R激动剂BK可激活B2R,增加缺氧复氧后神经元存活率,减少神经元凋亡,减轻细胞毒性作用。B2R激活后介导的神经保护作用可被其特异性抑制剂HOE140所抑制。结论:1、缺氧复氧可引起神经元生存率下降,LDH释放增加,诱导神经元凋亡。2、缓激肽B1R和B2R在神经元缺氧复氧损伤中分别介导不同作用,B1R激活后表现为加重神经元损伤,而B2R激活后可减轻缺氧复氧导致的神经元损伤。第三部分:缓激肽受体激活在体外培养的星型胶质细胞中的作用研究目的:1、观察缓激肽B1R和B2R在体外培养的星型胶质细胞中的表达及缺氧复氧后表达的变化。2、探讨缓激肽B1R和B2R激活后在体外培养的星型胶质细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法:应用免疫荧光双标法,检测缓激肽受体在体外培养的星型胶质细胞上的表达。应用RT-PCR和Western blot方法,观察星型胶质细胞缺氧复氧后缓激肽B1R和B2R mRNA及蛋白表达的变化。应用缓激肽B1R和B2R特异性激动剂和抑制剂,对星型胶质细胞进行干预,检测B1R和B2R激活或被抑制后对缺氧复氧诱导星型胶质细胞细胞因子分泌的影响。结果:1、体外培养的星型胶质细胞上存在缓激肽B1R和B2R的表达,与神经元上的分布相似,B1R主要表达于胞膜,而B2R主要表达于核膜。2、正常培养条件下星型胶质细胞上即可以检测到缓激肽B1R mRNA及蛋白表达,但表达量较低。缺氧复氧后B1R表达迅速上调,B1R mRNA表达在复氧后3 h达到高峰,而蛋白表达在复氧后6 h达峰,并持续在高水平表达。缓激肽B2R同样表达于正常培养状态下的星型胶质细胞,并可被缺氧复氧诱导。在缺氧3 h后,缓激肽B2R mRNa和蛋白表达水平均迅速上调,之后缓慢下降,但一直维持高于基线水平。3、缺氧复氧能诱导星型胶质细胞分泌细胞因子VEGF和GDNF。4、应用缓激肽B1R激动剂des-Arg9-BK能够抑制缺氧复氧诱导星型胶质分泌VEGF和GDNF,这一作用可被B1R特异性的抑制剂Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所抑制。缓激肽B2R激动剂BK可增强缺氧复氧诱导星型胶质细胞分泌细胞因子VEGF和GDNF,而应用B2R特异性抑制剂HOE140能够减少其分泌。结论:1、体外培养的星型胶质细胞上存在B1R和B2R的表达,并可被缺氧复氧所诱导。2、缺氧复氧可使星型胶质细胞分泌VEGF和GDNF增加,缓激肽B1R激活后可抑制其分泌而B2R激活后促进其分泌。第四部分:缓激肽受体作用的可能机制目的:应用体外培养的神经元缺氧复氧模型,探讨缓激肽B1R和B2R作用的信号通路及可能的机制。方法:建立神经元缺氧复氧模型,应用ELISA方法检测缺氧复氧所导致的神经元上ERK1/2、JNK以及p38信号通路的激活情况。Western blot检测缓激肽B1R和B2R特异性激动剂和抑制剂对ERK1/2、JNK以及p38信号通路磷酸化蛋白表达的影响。应用ERK1/2通路特异性抑制剂PD98059、JNK通路特异性抑制剂SP600125、p38通路特异性抑制剂SB203580,观察上述三条通路被阻断后缓激肽B1R和B2R在神经元缺氧复氧后作用的变化。主要观察指标包括:MTT法测定细胞存活率,LDH法测定细胞毒性。应用分光光度法检测Caspase-3活性,观察缓激肽B1R和B2R激活或被抑制后对缺氧复氧诱导神经元Caspase-3活性的影响。结果:1、缺氧后神经元ERK1/2、JNK和p38信号通路均被激活,并随复氧时间不同磷酸化蛋白表达水平呈现不同变化。ERK1/2通路在复氧1h左右磷酸化水平达到高峰,JNK通路磷酸化水平在复氧1-2h达峰而p38磷酸化水平在复氧30 min后即达到高峰。2、应用缓激肽B1R激动剂,可增加缺氧复氧后磷酸化JNK和p38的表达,这一作用可被其特异性抑制剂Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所部分抑制。应用缓激肽B2R激动剂,可增加缺氧复氧后磷酸化ERK1/2表达,抑制磷酸化JNK的表达,并且这一作用可被其特异性抑制剂HOE140所部分抑制。3、应用JNK特异性抑制剂SP600125,可抑制B1R激活后导致的神经元LDH释放增加,提高细胞生存率。而ERK1/2特异性抑制剂PD98059,可以抑制B2R介导的神经保护作用,使LDH释放增加,降低神经元生存率。4、缺氧复氧诱导神经元Caspase-3活性增强,B1R激动剂可使神经元缺氧复氧后Caspase-3活性进一步增强,而应用B2R激动剂可抑制Caspase-3活性的增加。结论:缓激肽B1R和B2R可能通过不同的信号通路发挥作用,B1R主要通过激活JNK和p38通路进一步激活Caspase-3途径介导神经损伤作用;而B2R主要通过激活ERK1/2通路,抑制JNK通路而进一步抑制Caspase-3途径介导神经保护作用。