研究背景与目的肺癌是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人们健康和生命的疾病。根据WTO数据统计，在2008年，全世界死于肺癌人数约占恶性肿瘤死亡的18.4％，居所有恶性肿瘤死因的第一位。肺癌主要有非小细胞肺癌和小细胞肺癌两种主要的病理类型。在所有的肺癌患者中，非小细胞肺癌约占总数的84%。尽管在过去的数十年中，肺癌的诊断和外科治疗已经取得了非常重大的进展，但是肺癌患者在过去30年中5年生存率仍旧低于15%，预后非常差。因此，对于肺癌发生，发展的分子机制的研究对于肺癌的预防和治疗都具有非常重要的意义。Notch基因的首次发现是在1919年，但直至20世纪80年代中期才被科学家首次克隆成功。随后的研究发现，Notch基因在无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中表达，其家族成员的结构具有高度保守性。一个完整的Notch信号通路包括Notch受体、配体、细胞内效应分子CSL蛋白、其他的效应物、Notch通路的调节分子等。目前，在哺乳动物体内共发现了四类Notch受体，包括Notch1，2，3，4，和五类配体包括Jagged1，Jagged2，Delta-like1，Delta-like3和Delta-like4。Notch信号通路在决定细胞的分化方向中发挥着重要的作用，该通路不仅对许多器官及细胞的正常发育起作用，且与一些肿瘤的发生、发展存在密切的关系。文献报道Notch通路在肺的发生，发育以及肺癌中都有着重要的作用，但其具体作用方式和作用机制均不详。众所周知，美国科学家Folkman于1971年首先提出肿瘤的生长与浸润依赖于肿瘤新生血管生成的理论。经过近30多年的研究，这一观点已被大量实验所证实，成为肿瘤研究领域的里程碑。目前，血管内皮生长因子（VEGF）是公认的作用最强、特异性最高的血管生长刺激因子，因此针对肿瘤血管的治疗主要集中对于抗VEGF及其受体的治疗，虽然这些药物都有一定疗效，但是仍有大部分肿瘤患者效果不佳，可能存在其他作用方式。Dll4是最后一个被成功克隆的Notch配体基因，该分子被认为是一个内皮细胞特异性表达的分子，研究发现Dll4介导的Notch信号通路与肿瘤中的血管发生有着密切关联。但是，对于该通路在肺癌中的作用及其可能的作用机制仍然不详。在生物体内，不同信号通路之间的交叉调控广泛存在。这种调控可以广泛拓展基因应对不同外界刺激对细胞的反应，这样对细胞生物学行为的调控更加丰富、有效。Notch通路已经被证实能与多种信号通路存在交叉调控的情况。近年来，Notch通路与Ras/MAPK通路、Wingless/WNT通路、β-catenin通路和PI3K-AKT等通路之间的互相作用受到广泛的关注。在PI3K-AKT信号通路中，抑癌基因PTEN在其中发挥着至关重要的作用，PTEN的失活必然导致PI3K-AKT通路活化，而活化的AKT具有多种生物学活性，可通过催化一系列蛋白质磷酸化作用促进肿瘤细胞生长、增殖，抑制凋亡，促进侵袭和转移，调控内皮生长、血管生成等生物学行为发生。因此，PI3K-AKT通路也被称之为PTEN-PI3K/AKT信号转导通路。目前，关于Notch通路与PTEN-PI3K/AKT信号通路之间的相互关系有了一定的研究，证实了Notch通路可通过PTEN的改变来影响AKT通路的变化而产生一定的生物功能，但是调控所发挥的生物学功能上没有形成统一的结论。因此，还有待进一步的研究来揭示其中的关系。因此，本课题试图通过设计一系列相关的实验来观察Dll4/Notch通路在血管内皮细胞中的作用、对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响，研究该通路调控的具体途径。此外，该通路与PTEN-PI3K/AKT通路是否存在交叉调控，具体作用方式是如何？本课题将依靠系统的分子生物学实验研究方法，揭示Dll4/Notch通路在肺癌中的作用及其具体分子机制，为肺癌的分子生物学治疗研究提供理论基础和实验依据。第一部分：Dll4分子对血管内皮细胞生物学作用的实验研究目的：通过实验观察Dll4分子对血管内皮细胞的增殖、迁移等生物学行为的影响情况，探讨Dll4介导的Notch通路的对血管内皮细胞的作用机制。方法：构建Dll4过表达质粒，设计Dll4分子特异性小干扰RNA片段，并构建真核表达质粒；通过转染、筛选建立Dll4的外源性过表达、干扰及其对照的血管内皮细胞HUVEC的稳定细胞株；通过细胞增殖生长、划痕迁移、血管腔形成等实验方法，观察Dll4分子对血管内皮细胞HUVEC的生物学功能的影响；通过real-time PCR、Westernblot方法检测Dll4分子的表达改变对Notch通路受体的表达的影响来初步探讨可能的分子机制。结果：1、利用多种方法在mRNA水平和蛋白水平检测发现：与对照细胞株（EC-EV）相比，血管内皮细胞HUVEC的Dll4细胞株（EC-Dll4）具有明显的Dll4过表达能力，而干扰细胞株（EC-shDll4）与对照组相比下能够抑制Dll4分子的表达水平。2、通过CCK-8体外增殖实验、划痕迁移实验和Matrigel胶的血管腔样结构形成实验发现：与对照组相比，Dll4分子过表达后能够显著抑制HUVEC细胞的增殖及迁移能力，同时减少了HUVEC细胞管腔形成的数量；而当Dll4分子的表达被有效干扰后，HUVEC细胞的生长、迁移与管腔形成能力明显增强。3、通过Westernblot蛋白电泳检测发现，Dll4分子对Notch1、Notch2和Notch3这三个Notch受体的蛋白表达均不产生明显影响。结论：血管内皮细胞稳定细胞株能够有效进行Dll4分子的研究实验。同时作为内皮细胞特异性的Dll4分子，能够明显抑制血管内皮细胞的体外生长、迁移和血管腔样结构形成的能力。Dll4分子对血管内皮细胞的生物学功能的影响可能不通过Notch1、Notch2和Notch3这三个Notch受体来激活。第二部分：血管内皮细胞Dll4分子对非小细胞肺癌细胞生物学作用的实验研究目的：观察血管内皮细胞上Dll4分子对非小细胞肺癌细胞的体外生长、凋亡生物学功能的影响和对肺癌裸鼠皮下荷瘤生长的作用，探讨血管来源Dll4分子对肺癌细胞上的Notch通路的影响、调控作用及存在的分子的机制。方法：使用重组人Dll4蛋白初步观察该分子对非小细胞肺癌A549细胞体外生长的影响；创建一种简单、有效的细胞体外共培养模型，通过共培养实验、流式细胞仪检测来观察血管内皮细胞上的Dll4分子对相邻肺癌细胞的体外生长、凋亡的影响；通过将肺癌细胞和血管内皮细胞混合后接种于裸鼠皮下建立动物荷瘤模型，观察Dll4分子对肺癌肿瘤生长、发展的作用；通过利用分子生物学研究的经典实验方法观察与Dll4分子相结合的Notch受体及其通路的激活状况；利用分子生物学技术改变Notch受体的表达状况来进一步观察其对肺癌细胞生长的影响，探讨血管上Dll4分子对肺癌细胞Notch通路的具体激活途径和方式，揭示其中的信号转导通路。结果：1、重组Dll4蛋白能够显著抑制肺癌A549细胞的体外增殖能力（P<0.05）。2、与EC-Dll4细胞株共培养72小时的A549、H460细胞的生长能力下降，与和对照EC-EV细胞株共培养的肺癌细胞A549、H460相比，有显著的统计学差异（P<0.01，P<0.05）；而与EC-shDll4细胞株共培养72小时后，A549、H460细胞的增殖倍数明显上升，和与对照EC-EV细胞株共培养的肺癌细胞A549、H460相比，在统计学上有显著的差异（P<0.05，P<0.01）。3、在共培养实验中，A549细胞的凋亡率在三组间无明显的差别。4、与对照A549+EC-EV组肿瘤相比，A549+EC-Dll4组的肿瘤生长明显受到抑制，而与对照组相比之下A549+EC-shDll4组的肿瘤生长的体积和重量显著增加，统计学差异明显。5、肿瘤组织切片免疫组化显示：与A549+EC-EV组相比，增殖指标Ki67在A549+EC-Dll4组中的阳性程度明显下降，而在A549+EC-shDll4组则显著上升。6、血管指标CD34在A549+EC-Dll4组中的阳性的数量与A549+EC-EV组相比下降，而在A549+EC-shDll4组中的CD34阳性数量与对照相比显著增加。7、无论是体外细胞实验还是荷瘤组织中，过表达Dll4分子使肺癌细胞中的Notch1受体在mRNA水平和蛋白水平的表达均上升，同时其下游靶基因HES1、HEY1的表达也同向发生变化。当Dll4干扰后出现相反的结果。Notch2、Notch3无明显变化。8、当Notch1的表达升高时A549细胞的生长速度减慢，而Notch1基因沉默后肺癌细胞增殖明显增加。9、建立A549的Notch1干扰细胞系后加入rhDll4后与对照相比对肺癌细胞体外生长的抑制能力明显下降。结论：血管内皮细胞上的Dll4分子对相邻肺癌细胞的增殖、肿瘤的生长能力产生一定的抑制作用。这种生物学调控可能主要通过Dll4分子与肺癌细胞上的Notch1受体结合使Notch1活化、启动下游HES1和HEY1表达，激活Notch信号通路来实现的。整个过程中Notch2和Notch3受体无明显变化。第三部分：Dll4/Notch1通路对PTEN-PI3K/AKT信号通路交叉调控的实验研究目的：观察肺癌细胞Notch1通路激活后对PTEN基因表达的影响，初步探讨Dll4/Notch1通路对PTEN-PI3K/AKT通路之间是否存在交叉调控的关系以及可能的调控的方式。方法：采用real-time PCR、Westernblot和细胞免疫荧光等多种实验方法观察Dll4分子表达改变后与其接触的肺癌A549细胞中PTEN基因、AKT基因表达的变化。观察Notch1的活化或特异性干扰后对PTEN表达水平的变化及关系。结果：1、A549细胞与EC-Dll4接触后，其细胞内PTEN的mRNA水平的表达量与对照细胞中的含量相比出现了显著的上升。2、裸鼠肿瘤组织中，A549+EC-Dll4组的PTEN含量无论是mRNA水平还是蛋白质水平上，都出现了显著的上升变化；A549+EC-shDll4组与A549+EC-EV组的肿瘤相比，PTEN基因的表达量都出现了明显的下降改变。3、Dll4蛋白使A549细胞Notch1表达上升的同时，PTEN蛋白的表达量和它磷酸化形式p-PTEN的量也明显增加,而p-AKT的表达水平轻度下降。4、A549细胞中外源性N1ICD表达增加时，PTEN蛋白的表达也有所上升；5、Notch1外源性表达或被特异性干扰后，PTEN和它磷酸化形式p-PTEN的量的表达水平也出现上升和下降的改变。结论：Dll4/Notch1通路对抑癌基因PTEN有明显的正调控作用，通过PTEN对PI3K/AKT通路存在交叉调控作用。Dll4/Notch1通路可能通过对抑癌基因PTEN的调控来影响肺癌细胞的生物学功能。