本课题的研究主要分为以下三个部分： 第一部分 慢性高眼压大鼠模型的建立 一、研究目的： 采用巩膜表面静脉注射高渗盐水法建立大鼠慢性高眼压模型，分析RGCs凋亡趋势，为后续的实验研究提供稳定可靠的慢性青光眼大鼠供体。 二、研究方法： 采用成年雄性Brown—Norway大鼠，右眼为对照组，左眼为实验组。实验组巩膜表面静脉注射1.75M高渗盐水，建立慢性高眼压大鼠模型。以TonoLab眼压计于术前一周至术后14天每日固定时间监测清醒状态下双眼眼压变化。实验组术后14天内眼压平均值高于对照组5mmHg视为眼压增高。在146只大鼠造模尝试成功基础上，对11只成功造模的大鼠进行数据分析。术后第14天，上丘逆行标记RGCs，术后第17天，视网膜平铺片并计数，分析高眼压下RGCs凋亡规律。如RGCs凋亡呈青光眼性RGCs凋亡规律，结合眼压增高，视为造模成功。 三、研究结果： 11只成功建立的大鼠慢性高眼压模型中，实验组术后3～5天眼压开始升高，比较术后14天眼压平均值，实验组明显高于对照组(27.1±1.9 mm Hg vs．18.7±0.2 mm Hg，t=2.23，p<0.01)。术后第17天，实验组各区域RGCs数明显少于对照组，其细胞凋亡量化趋势符合青光眼性RGCs凋亡规律，由周边到中央区域RGCs数量分别减少29.8％、19.9％、19.2％(p<0.05)。 四、小结： 成功建立慢性高眼压大鼠模型，其RGCs凋亡符合青光眼性RGCs凋亡规律，可以用于后续研究。 第二部分 慢性高眼压大鼠模型玻璃体液ATP及视网膜NTPDasel蛋白水平测定 一、研究目的： 在成功建立的慢性高眼压大鼠模型中，研究高眼压下玻璃体液ATP浓度、视网膜NTPDasel蛋白表达水平与眼压的关系。 二、研究方法： 建立慢性高眼压大鼠35只，右眼为对照组，左眼为实验组。以TonoLab眼压计，于术前一周至术后14天，每日固定时间监测清醒状态下双眼眼压变化。于术后第14天，通过干冰速冻法获取玻璃体液及视网膜，应用萤光素/萤光素酶法测定大鼠玻璃体液中ATP含量，应用Western blot分析视网膜NTPDasel蛋白表达水平。 三、研究结果： 实验组术后14天眼压平均值为29.8±1.4 mm Hg，对照组为18.2±0.8 mm Hg(t=1.81，p<0.01)。术后第14天，实验组玻璃体液ATP浓度为对照组的32.5倍；实验组视网膜NTPDasel蛋白表达水平为对照组的1.16倍；经统计学分析，玻璃体液ATP浓度、视网膜NTPDasel蛋白表达水平分别与眼压变化呈一阶线性回归关系(r2分别为0.826，0.786)。 四、小结： 慢性高眼压大鼠模型中，玻璃体液ATP浓度及视网膜NTPDasel蛋白表达水平增高；且随着眼压的升高，二者与眼压变化呈一阶线性回归关系。表明高眼压状态下，体内嘌呤水平呈上调趋势。 第三部分 ATP受体P2X7与腺苷受体A3对RGCs的体内作用研究 一、研究目的： 运用ATP受体P2X7特异性激动剂及拮抗剂与腺苷受体A3特异性激动剂对体内RGCs进行药物干预，初步探讨二者的激动剂或拮抗剂对体内RGCs的损伤或保护作用。 二、研究方法： 取出生后14-26天新生Long—Evans大鼠155只进行实验研究。 1.随机选取大鼠27只，检测P2X7受体特异性激动剂BzATP对体内RGCs的致凋亡作用。于实验第一天行玻璃体注射，随机选取一眼设为实验组，另一眼设为对照组。实验组注射BzATP1μL，对照组注射同等剂量平衡盐溶液(BSS)。于实验第四天，上丘逆行标记RGCs。于实验第七天，采用视网膜平铺片，在荧光显微镜下观察并计数，对结果进行统计学分析。 2.在BzATP能明显降低体内RGCs数量的实验结果基础上，分以下三组研究P2X7受体拮抗剂及腺苷受体A3激动剂对体内RGCs的保护作用。于实验第一天行玻璃体注射，随机选取一眼设为实验组，另一眼设为对照组。 第一组：随机选取大鼠48只，实验组注射10mM P2X7受体拮抗剂BBG与250μMBzATP混合溶液1μL，对照组注射同等剂量250μM BzATP。 第二组：随机选取大鼠38只，实验组注射10μM P2X7受体特异高效拮抗剂MRS2540与250μM BzATP混合溶液1μL，对照组注射同等剂量250μM BzATP。 第三组：随机选取大鼠42只，实验组注射10μM腺苷受体A3特异高效激动剂MRS3558与250μM BzATP混合溶液1μL，对照组注射同等剂量250μM BzATP。 于实验第四天，上丘逆行标记RGCs。于实验第七天，采用视网膜平铺片，在荧光显微镜下观察并计数，对结果进行统计学分析。 三、研究结果： 通过统计分析不同处理组间的结果显示：玻璃体注射250μM P2X7受体特异性激动剂BzATP能明显减少RGCs数量，以注射点附近的鼻侧和上侧最为显著，RGCs数量分别减少23.5％和19.4％(p<0.001)。玻璃体注射10mM P2X7受体拮抗剂BBG可阻止BzATP的致凋亡作用，鼻侧和上侧RGCs存活率分别增加21.8％和18.6％(p<0.01)。玻璃体注射10μM P2X7受体拮抗剂MRS2540可使鼻侧和上侧RGCs存活率分别增加23.8％和55.6％(p<0.01)。玻璃体注射10μM腺苷受体A3激动剂MRS3558可使鼻侧和上侧RGCs存活率分别增加22.2％和15.5％(p<0.001)。 四、小结： 玻璃体注射P2X7受体特异性激动剂BzATP能明显减少RGCs数目。P2X7受体拮抗剂BBG及MRS2540、A3受体激动剂MRS3558可明显阻止BzATP导致的细胞凋亡作用。 结论： 1.应用巩膜表面静脉注射高渗盐水法成功建立了慢性高眼压大鼠模型。 2.在慢性高眼压大鼠模型中发现高眼压状态下，体内ATP及NTPDasel蛋白表达水平均升高，且二者与眼压呈线性关系，即随着眼内压的升高，玻璃体腔ATP水平升高，视网膜NTPDasel蛋白表达水平也升高，嘌呤水平呈上调状态。 3.ATP受体P2X7特异性激动剂BzATP在体内具有致RGCs凋亡作用，其特异性拮抗剂BBG及MRS2540可保护RGCs。 4.腺苷受体A3特异性激动剂MRS3558具有显著的保护体内RGCs作用。 本研究成功建立慢性高眼压大鼠模型，为后续研究提供了较好的研究供体；在该模型基础上探讨的有关嘌呤及其受体对体内RGCs的作用，与前期大量体外实验结果相一致。本研究为青光眼发病机制及神经保护的研究提供了新的思路，为青光眼性视神经病变的预防和治疗提供了可能的药物靶点。