目的:哈蟆油目前的质量评价仅能以经验判断为主,《中国药典》等尚无对哈蟆油的质量评价方法,其成分复杂,药效物质基础不明确,功效与成分难以关联。单以成分为指标,难以实现哈蟆油质量控制的突破。本研究拟以文献考证为指标筛选依据,建立基于抗衰老生物效价的哈蟆油质量控制与评价模式和方法,以补充和完善现行哈蟆油质量控制与评价体系。方法:（1）通过查阅国内历代记载哈蟆油的史料,对哈蟆油基原动物记载演变过程及哈蟆油药效发展规律进行了系统梳理,厘清哈蟆油基原物种及功能主治。（2）以H2O2诱导的人肺胚成纤维二倍体细胞MRC-5（以下简称MRC-5细胞）急性衰老模型和自发复制性衰老模型为研究对象,以CCK-8法检测细胞活力,筛选最佳给药剂量,继而考察哈蟆油预处理对衰老MRC-5细胞β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色阳性率的影响,采用流式细胞仪,分析细胞周期变化。采用相关试剂盒检测哈蟆油对衰老MRC-5细胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平的影响。采用Western blot法检测蛋白衰老相关蛋白p16、p53、Id-1、p21的表达情况。（3）采用连续8周皮下注射高剂量的D-半乳糖（D-gal）建立亚急性衰老小鼠模型,并基于该模型评价哈蟆油的抗衰老作用。实验分为空白组、模型组、阳性对照组(Vc 200mg·kg-1)、哈蟆油低、中、高剂量组(生药量100、200、400 mg·kg-1)。通过行为学实验评判不同剂量的哈蟆油对衰老小鼠认知能力的改善作用。在此基础上,检测血清生化指标SOD、MDA、GSH-Px水平的影响。H＆E染色观察小鼠肝、心、脑、肾、肺组织形态变化。同时,采用免疫组化染色检测各组小鼠海马组织的p53、p21表达水平,Western blot法检测脑组织中p53和p21蛋白表达水平。（4）以相对增殖率为评价指标,采用“质反应平行线法”建立基于抗衰老活力的哈蟆油生物效价测定方法,进行方法学考察,测定12个批次哈蟆油的生物效价与可信限度。同时,测定各产地哈蟆油药材的1-甲基海因、膨胀度、总蛋白含量,计算与生物效价的相关性差异,评价各指标与抗衰老生物效价的相关度。结果:（1）哈士蟆（哈蟆油）之名在清代初期为满语音译,指的是蝲蛄属动物。至清代中后期,将东北林蛙作为哈士蟆的叫法逐渐被满、汉两种文化接受。哈蟆油基原动物东北林蛙的性状描述始于《盛京通志》,结合其形态描述、产区分布,即为今之东北林蛙Rana dybowskii Günther。沿哈蟆油功效记载脉络而言,哈蟆油自满清时期以来即主于“补肾”之功,于医家、民间皆用以滋补强壮、延缓衰老,并非山蛤所载“治小儿痨瘦与疳疾”。（2）细胞活力检测表明,H2O2可对MRC-5细胞造成衰老损伤,且其损伤程度呈剂量、时间依赖性增加,当H2O2浓度为50μM,孵育24 h时,基本达到最大损伤程度,Ki67阳性细胞的比例明显少于对照组（P＜0.01）。以Vc作为阳性对照,哈蟆油干预MRC-5细胞培养后,可拮抗急性衰老和复制性衰老损伤,且效果呈剂量依赖性增加,于250μg/m L效果达到最佳（P＜0.01）。哈蟆油预处理可减弱急性衰老细胞和复制性衰老细胞的SA-β-gal活性。与急性衰老模型组对比,哈蟆油和Vc预处理的细胞生长期S期显著增加（P＜0.05）,表明哈蟆油可以通过增加细胞快速增长期（S期）而减缓MRC-5细胞衰老。通过试剂盒检测证明,哈蟆油能有效提高衰老模型细胞内SOD、GSH-Px的活性（P＜0.05,P＜0.01）、降低MDA水平（P＜0.01）。采用Western blot法检测衰老相关蛋白表达的情况,随着哈蟆油药物浓度的增加,Id-1蛋白表达呈浓度依赖性上升（P＜0.01）,p16、p21、p53蛋白呈浓度依赖性下调（P＜0.01）。（3）采用D-gal构建小鼠衰老模型,与空白对照组比较,模型组小鼠衰老症状明显,通过Morris水迷宫实验、旷场实验、悬尾实验证实,衰老小鼠在行为学上与空白组差异明显,而各给药组小鼠衰老症状明显好转。哈蟆油能够呈剂量依赖性升高D-gal诱导小鼠血清SOD和GSH-Px活性,降低MDA水平。H＆E染色结果显示,与对照组比较,模型组小鼠肝、心、脑、肾、肺组织切片中组织损伤严重,中、高剂量哈蟆油组小鼠组织切片中,形态与排列均明显改善,可见,哈蟆油有效改善了D-gal刺激小鼠衰老而导致的脏器组织损伤。通过对小鼠海马免疫组化染色显示,模型组小鼠海马组织中p53、p21蛋白表达水平升高。给予模型小鼠哈蟆油后,小鼠海马中p53、p21蛋白表达水平降低。Western blot法检测各组小鼠脑组织中p53和p21蛋白表达水平,模型组小鼠脑组织中p53和p21蛋白表达水平明显高于对照组;与模型组比较,中、高剂量哈蟆油组小鼠脑组织中p53和p21蛋白表达水平下调。（4）建立了哈蟆油抗衰老生物效价的检测方法,方法学考察RSD值符合要求。对国内外12批样品进行检测,不同产地哈蟆油药材抗衰老活力效价范围为218.03～1152.04 U·mg-1,靖宇、桦甸等区域所产的哈蟆油药材效价较其他产地为佳,从质量分布上,形成明显的以长白山腹地为质量核心区逐渐向四周衰减的分布趋势。不同产地哈蟆油药材的1-甲基海因、膨胀度、总蛋白含量差异显著,经Pearson相关性分析,哈蟆油的总蛋白含量与抗衰老效价指标显著正相关（r=0.931）。结论:本研究基于文献考证,明确了哈蟆油的历史沿革,厘正了哈蟆油的基原,确定了其补肾-抗衰老的传统功效。基于MRC-5细胞的急性衰老模型、自发复制性衰老模型及D-gal诱导的小鼠衰老模型,证实哈蟆油具有抗衰老的直接作用。基于以上研究,建立了哈蟆油的抗衰老生物效价检测方案,可明显区分哈蟆油质量差异,尽可能地反映了其“功能主治”,弥补了目前哈蟆油质量控制的缺陷,为其他补肾类药材的质量控制和品质评价提供了新的思路和方法。