大叶贯众(Cyrtomium macrophyllum (Makino) Tagawa f. muticum (Christ) Ching et Shing (Dryopteridaceae)),属于鳞毛蕨科贯众属植物。据《中国植物志》记载,该植物植株高约70 cm,叶柄长约58 cm,基部直径约5 mm,禾杆色,腹面有浅纵沟,下部密生卵形及披针状棕色鳞片,鳞片边缘流苏,向上渐稀疏；叶片矩圆披针形,长约42 cm,宽约18 cm,先端急尖,奇数一回羽。叶为革质,背面有稀疏的毛状鳞片。孢子囊群成不整齐的多行,无囊群盖。大叶贯众作为我国一种常见的民族药用植物,已有上千年的历史。民间多用其煎剂治疗多种疾病,如流感、流行性乙型脑炎、止血及子宫出血等。有研究表明,贯众属植物主要具有抗氧化、抗菌、抗寄生虫、抗病毒和抗癌等活性,已知的活性组分有黄酮、间苯三酚类衍生物、三萜类、单宁、油脂及多糖等物质。但是关于大叶贯众活性和结构的研究寥寥无几,因此,本研究选取大叶贯众为研究对象,以环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠为研究动物。首先对其安全性进行了评价,再通过对小鼠增强免疫和抗氧化试验,探讨其免疫增强效果和机理,并对其活性成分即多酚类化合物进行分离纯化、成分鉴定和抗氧化作用的研究,为进一步探讨大叶贯众的药效和开发奠定基础。试验分为以下六个部分：试验I大叶贯众的制备和安全性测定用水煎法提取大叶贯众,经冷冻干燥,得到大叶贯众水提物。利用Folin-Cioealteu法、硝酸铝-亚硝酸钠法和硫酸苯酚法分别测定大叶贯众水提物中多酚、黄酮和多糖的含量；并按照兽药试验技术文献分别进行急性毒性试验和亚慢性毒性试验,对其安全性进行评估。结果显示,大叶贯众水提物中多酚、黄酮和多糖的含量分别为272.47±12.89 mg·g-1.182.44±2.71 mg·g-1和43.73±1.21 mg·g-1；在急性毒性试验中,每次给药后1小时内小鼠有精神稍差、扎堆及食欲减退等不适反应,但很快恢复正常,此后未出现任何异常现象,同时无小鼠死亡；LD50>5000 mg·kg-1,属于实际无毒级。在亚慢性毒性试验中,高剂量组小鼠体重显著低于中、低剂量组,但是与对照组之间差异不显著；高剂量组白细胞总数显著大于对照组；各组血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、甘油三酯和尿素氮无显著差异；脏器指数与对照组无显著性差异；剖检和病理组织学检查未见明显异常。以上结果表明大叶贯众水提物无毒,无明显的亚慢性毒性,可应用于临床。试验Ⅱ大叶贯众水提物对小鼠淋巴细胞增殖及其机理的研究为了研究大叶贯众水提物增强免疫的作用机理,分别研究了大叶贯众水提物对小鼠淋巴细胞的增殖及淋巴细胞中IL-2和IL-6的mRNA表达。以体外培养的小鼠淋巴细胞为试验模型,分别加入8种浓度的大叶贯众水提物(7.82～500 μg·mL-1),同时设ConA和LPS对照。结果表明CMAE能协同ConA和LPS促进淋巴细胞增殖,对于T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖的作用分别在250 μg·mL-1和15.63 μg·mL-1时效果最好(P<0.05)。细胞因子表达试验中,以体外培养的小鼠淋巴细胞为试验模型,分别加入3种浓度的大叶贯众水提物(7.82、15.63 and 31.25μg·mL-1),同时设ConA对照。淋巴细胞在培养24 h后,收集细胞,提取总RNA,然后进行反转录,用荧光定量PCR方法测定其IL-2和IL-6的mRNA表达的变化。结果表明,CMAE均能显著促进T淋巴细胞IL-2和IL-6的mRNA表达,当浓度为15.631时,IL-2的mRNA表达量最高(P<0.05)；而当浓度为31.25μg·mL-1时IL-6的mRNA表达量最高(P<0.05)。试验Ⅲ大叶贯众水提物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响将雄性Balb/c小鼠90只随机分为6组,除健康对照组和阳性对照组外,3个试验组和模型组均腹腔注射80mg·kg-1·d-1环磷酰胺,连续3 d,然后3个试验组灌胃给予25、50、100mg·kg-1的CMAE,健康对照组和模型对照组给予生理盐水,阳性对照组灌胃给予100 mg·kg-1的CMAE,持续18 d。于最后一次给药24h后,每组抽取3只小鼠用碳粒廓清试验检测巨噬细胞的吞噬指数,3只小鼠用MTT法测定淋巴细胞增殖,其余小鼠称重后每组眼球采血后,颈椎脱臼处死,并采集内脏称重,计算脾、胸腺指数,检测其细胞因子IL-2和IL-6的表达。结果显示,CMAE高剂量组的免疫器官指数、淋巴细胞增殖、吞噬指数及IL-2和IL-6的表达量均显著高于模型对照组(P<0.05)。结果表明,CMAE可逆转环磷酰胺诱导的免疫器官萎缩,增强免疫抑制小鼠的淋巴细胞和巨噬细胞的功能及促进细胞因子的生成。试验Ⅳ大叶贯众水提物体外抗氧化研究将大叶贯众的水提物,分别进行DPPH自由基的能力、清除羟自由基的能力、清除超氧阴离子的能力和总还原力的测定。结果表明,大叶贯众水提物在体外抗氧化的四个指标中,表现出良好的抗氧化能力,尤其在清除羟自由基的试验中,CMAE和Vc的IC50值分别为157.59±6.82μg·mL-1和201.37±5.71 μg·mL-1,表明CMAE比阳性对照Vc的作用强,而在清除DPPH自由基、清除超氧阴离子和总还原力的试验中,CMAE的IC50分别为14.85±0.21 μg·mL-1、59.12±0.77μg·mL-1和196.36 ±5.68 μg·mL-1而Vc的IC50分别为11.01±0.09μg·mL-1、43.57±0.26 μg·mL-1和106.71±3.61μg·mL-1,表明CMAE比阳性对照Vc的作用稍差。试验Ⅴ大叶贯众水提物对免疫抑制小鼠抗氧化功能的影响雄性BALB/c小鼠60只随机分为6组。3个CMAE组和模型对照组分别腹腔注射80 mg-kg-1·d-4环磷酰胺,连续3 d,然后3个CMAE组灌胃给予25、50、100 mg-kg-1的CMAE,健康对照组和模型对照组给生理盐水,阳性对照组灌胃给予100 mg-kg-1的CMAE,持续18 d。于最后一次给药24 h后,采集心、肝、肾组织。测定心、肝、肾匀浆液中蛋白、T-AOC、MDA、CAT、SOD和GSH-Px水平。结果显示,与模型对照组相比,CMAE高剂量组的SOD、CAT、GSH-Px和TAOC活性显著增加(P<0.05),所有剂量组的MDA水平显著降低(P<0.05)。结果表明,CMAE可以有效地清除自由基。试验Ⅵ大叶贯众中多酚提取物对免疫抑制小鼠抗氧化功能的影响对大叶贯众多酚类化合物进行提取,利用HPD600大孔树脂纯化,将纯化产物进行UHPLC-LTQ-Orbitrap分析,并探讨大叶贯众多酚提取物对小鼠抗氧化功能的影响。将雄性BALB/c小鼠60只随机分为6组。3个CMPE组和模型对照组分别腹腔注射80 mg-kg-1·d-1环磷酰胺,连续3d,然后3个CMPE组灌胃给予50、100、200 mg-kg-1的CMPE,健康对照组和模型对照组给生理盐水,阳性对照组灌胃给予200 mg-kg-1的CMPE,持续18 d。于最后一次给药24 h后,采集心、肝、肾组织。测定心、肝、肾匀浆液中蛋白、T-AOC、MDA、CAT、SOD和GSH-Px水平。结果显示,利用HPD600大孔树脂进行纯化后,多酚含量达到820.8±3.25 mg-g-1；利用UHPLC-MS/MS初步鉴定出11个多酚类化合物,与模型对照组相比,CMAE高剂量组的SOD、CAT、GSH-Px和TAOC活性显著增加(P<0.05),中、高剂量组MDA水平显著降低(P<0.05)。结果表明,CMAE可有效地清除自由基,为后续的功能性研究奠定基础。