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花青苷作为一种黄酮类化合物,由糖和花色素通过糖苷键结合而成。在植物中,它是重要的代谢次生物,主要分布在叶,花,种子,果实和其他器官组织中的液泡中。其中在葡萄,苹果,草莓,红梨,山竹等一些成熟果实中有较高的含量,是决定果实色泽的重要因素。花青苷不仅可以使水果具有丰富的色彩,而且对预防心血管疾病,减少肥胖症和改善人体血糖平衡发挥重要作用。花青苷的生物合成受各种因素调控,包括合成途径中的结构基因,转录因子及外界环境因子等,其中结构基因花色素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)和尿苷二磷酸葡萄糖:类黄酮-3-O-糖基转移酶(UDP glucose:flavonoid 3-O-glycosyl transferase,UFGT)以及参与调控结构基因的MYB-bHLH-WD40复合体起到了关键作用。目前,已在梨(PyMYB10),桃(PpMYB10),葡萄(VvMYBA1和VvMYBA2),草莓(FaMYB10)和苹果(MdMYB1)中发现了与拟南芥中花青苷生物合成有关的AtMYB75的同源基因,在红肉苹果中,MdMYB10能够结合自身的启动子来增强对花青苷的调控,此外,bHLH3/33能够受低温诱导促进花青苷的积累。然而,MYB抑制子和bHLH家族参与花青苷代谢的机理尚不清楚。因此,本研究选取新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1、2、3、4、5号’苹果为试材,其果肉均呈不同程度的红色,从果实发育期及成熟期测定并分析果实花青苷含量与MYB抑制子和MdbHLH33等相关转录因子的表达水平,分析MdbHLH33和MYB抑制子的互作关系,鉴定MYB抑制子的下游靶基因等方面展开研究,主要结果如下:1.‘红脆1号’苹果在果实发育期(60-130d)花青苷含量逐渐降低,MdMYB9,MdMYB10,MdMYB11,MdMYBPA1,MdbHLH3和MdbHLH33的表达水平呈下降趋势,而MdMYB16和MdMYB6的表达水平呈上升趋势;‘红脆3、4号’在果实成熟期(130d)花青苷含量明显高于‘红脆1、2、5号’,而MdMYB16和MdMYB6的表达水平低于‘红脆1、2、5号’。因此,MYB抑制子MdMYB16和MdMYB6的差异表达在‘红脆1、2、3、4、5号’苹果果实着色差异中有着重要作用。2.MYB相关转录因子进化树分析表明MdMYB16和AtMYB4在同一个进化枝上,区别于FaMYB1等其他MYB抑制子;在红肉愈伤中,超表达MdMYB16能够抑制UFGT和ANS的表达并降低花青苷的含量;酵母单杂交发现,MdUFGT和MdANS的启动子可以被MdMYB16结合。因此,MdMYB16能够直接结合花青苷生物合成中的关键结构基因ANS和UFGT启动子,抑制它们的表达,从而降低花青苷含量。3.酵母双杂交、Bifc和pull-down分析表明MdMYB16能够与自身互作形成同源二聚体,且能够与MdbHLH33互作形成异源二聚体,当敲除MdMYB16的bHLH结合基序后发现,LBSMdMYB16(敲除bHLH结合基序)不能够与MdbHLH33互作;在超表达MdMYB16的愈伤中超表达MdbHLH33,发现其能够削弱MdMYB16在花青苷合成中的抑制效应;然而在超表达LBSMdMYB16的愈伤中过表达MdbHLH33,发现其不会削弱MdMYB16在花青苷合成中的抑制效应。因此,MdbHLH33能够通过与MdMYB16互作形成异源二聚体来减弱MdMYB16对花青苷的抑制作用。4.分析MdMYB16的蛋白结构发现其C端存在一个EAR序列,敲除其EAR抑制序列将其命名为LESMdMYB16,在红肉愈伤中过表达LESMdMYB16发现其不能够降低ANS和UFGT的表达量和花青苷含量;酵母单杂交发现,MdUFGT和MdANS的启动子同样能被LESMdMYB16结合。因此,MdMYB16通过自身EAR序列发挥抑制花青苷的作用。5.MdbHLH33作为一个已知的花青苷合成激活因子,在红肉愈伤中过表达后,其能够提高花青苷的含量。酵母双杂交和pull-down分析表明MdMYB15L能够与MdbHLH33互作;在红肉愈伤中超表达MdMYB15L后,发现其不能影响花青苷含量,然而,在超表达MdbHLH33的愈伤中再超表达MdMYB15L,发现其能够减弱MdbHLH33对花青苷的促进作用。因此,我们敲除了MdMYB15L的bHLH结合基序,将其命名为LBSMdMYB15L,酵母双杂交分析发现LBSMdMYB15L不能够与MdbHLH33互作;在超表达MdbHLH33的愈伤中超表达LBSMdMYB15L,发现其不能够减弱MdbHLH33对花青苷的促进作用。6.在红肉愈伤中过表达MdMYB6能够降低花青苷的含量;采用TMT定量蛋白质组学技术对红肉愈伤和过表达MdMYB6的红肉愈伤这两组进行蛋白组差异分析,共筛选到1086个差异表达的蛋白,GO功能分析发现,其功能主要是结合,催化,转运蛋白活性和分子功能调节剂,KEGG通路表明其主要参与了细胞过程,代谢过程,生物调控和定位等重要生物学过程;在过表达MdMYB6的红肉愈伤中,下调表达的蛋白包括MdANS,MdFLS,MdGSTF12,MdCHS和MdF3H,其中MdANS和MdGSTF12是花青苷生物合成的关键蛋白;通过酵母单杂交和EMSA分析表明,MdMYB6能够结合MdANS启动子上的MRE元件和MdGSTF12启动子上的MBS元件。综上所述,MdMYB6能够直接抑制MdANS和MdGSTF12的表达,从而抑制花青苷的生物合成。7.进一步研究表明,在过表达MdMYB6的愈伤中发现了一个上调表达蛋白,单糖转运蛋白TMT1;氨基酸序列分析发现其具有12个跨膜结构,亚细胞定位发现其定位于苹果愈伤的液泡膜;在红肉愈伤中过表达MdTMT1发现其能够降低UDP-glu和UDP-gal以及花青苷的含量,UDP-glu和UDP-gal是花青苷生物合成不可或缺的底物,因此MdTMT1在花青苷合成中发挥着重要作用;GUS活性,酵母单杂交,Chip-PCR和EMSA分析表明MdMYB6能够结合MdTMT1启动子并促进其活性;在过表达MdTMT1的愈伤中过表达MdMYB6能够提高MdTMT1的表达水平,减少UDP-glu和UDP-gal的含量。因此,MdMYB6能够通过促进MdTMT1的表达来间接减少花青苷的含量。