Neuregulin(NRG)是一类属于表皮生长因子家族的多肽因子，由NRG基因的编码产物选择性剪切体所组成。在NRG的多种异构体中(NRG1-4)，对NRG1研究最为广泛。NRG1蛋白在神经系统的发育中发挥着重要的作用：它参与了神经细胞的分化、神经元的迁移、神经突起的外向性生长和突触的形成。NRG1的功能性受体是ErbB受体酪氨酸激酶，包括ErbB2、ErbB3和ErbB4。其中，ErbB4可能是NRG1在脑内发挥调节功能的最主要的受体。最近，NRG1和神经系统疾病的关系引起人们广泛关注，在冰岛、苏格兰、爱尔兰、中国和韩国等人群的分子遗传学研究结果表明：NRG1和ErbB4是精神分裂症的易感基因。尽管NRG1和ErbB受体酪氨酸激酶在成年的啮齿类动物和人的大脑中也高度表达，然而目前对于NRG1在神经系统功能的认识绝大部分仅限于早期发育阶段，对于NRG1/ErbB信号通路在成年脑区中的作用以及对于其在精神分裂症中的病理机制仍然不清楚。　　 以往的研究表明海马是一个与精神分裂症密切相关的脑区，NRG1和ErbB4在成年脑区的海马都有丰富的表达。其中NRG1的mRNA在CA3锥体神经元高表达，CA3锥体神经元发送Schaffer侧支到CA1的辐射层(SR)，终止于CA1区神经元的树突；而ErbB4在海马CA1区高度表达，提示合成的NRG1可能由CA3锥体神经元的轴突释放，激活CA1区的ErbB4受体，从而发挥生物学功能。近年来有研究表明ErbB4蛋白多聚集在在成年动物中枢神经元的突触后密集区(postsynaptic density，PSD)，它的C-末端与含有突触后致密体(postsynapticdensityzone，PDZ)结构域的蛋白致密体-95(PSD-95)支架相关蛋白相结合。同时ErbB4和PSD-95的结合是一个动态的过程，它受到神经元的活动以及NRG1蛋白的影响；并RNRG1的加工和释放的调节也是活动依赖性的。上述研究结果提示NRG1/ErbB4信号通路可能在突触传递或突触可塑性方面发挥重要作用。　　 近年来一些研究结果相继表明，NRG1可以调制海马CA1区的长时程增强现象(long-term potentiation，LTP)。Huang等人最早发现在4-6周龄大鼠海马脑片，急性灌流NRG1可以明显抑制由强直刺激(tetanus)在Schaffer侧枝-CA1突触诱导的LTP，而不影响基本的突触传递。阻止ErbB4受体募集入脂筏(脂筏是细胞膜上富含鞘脂和胆固醇的微区结构，脂筏为细胞表面发生的蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂类分子间的相互作用提供了平台)可以减弱NRG1对这种LTP诱导的抑制作用。另外，抑制ErbB4受体或在ErbB4基因缺失突变小鼠的海马脑片则增强了由θ节律刺激诱导的LTP，这些研究结果都表明NRG1通过ErbB4活动抑制了LTP的诱导。但是对于NRG1/ErbB4对LTP调制作用的根本机制仍然不明。虽然PSD95在突触后密集区通过PDZ与NMDA受体的C末端结合，同时有报道称NMDA受体也可以被酪氨酸激酶磷酸化调制，然而我们先前的实验发现NRG1对于基本的突触传递MDA受体所介导的反应没有作用，提示NRG1/ErbB4信号通路对LTP调制的作用机制可能与NMDA受体无关。　　 我们以前的研究发现ErbB4与经典的GABA能神经元末梢标志物如囊泡转运体(VGAT)、GAD65共定位于突触前神经末梢。在成年啮齿类动物海马中，ErbB4的mRNA在海马CA1区高度表达，应用免疫荧光染色法显示在CA1区ErbB4表达最高的是GABA能中间神经元。而在培养的海马细胞中，超过9896的ErbB4阳性细胞是GABA能神经元。这些证据表明ErbB4受体主要存在于GABA能中间神经元的突触前末梢。而且，GABA能抑制性中间神经元对于维持中枢神经系统正常功能有着非常重要的作用。病理学分析显示精神分裂症与异常GABA能突触传递有关，目前认为这种GABA能传递的异常会导致精神分裂症患者认知功能的缺损。另外，我们先前的研究发现在成年小鼠的皮层中，NRG1增强了去极化引起的GABA从突触前膜释放，而在ErbB4突变的小鼠脑片上这种作用被消除。目前，我们尚不清楚在海马NRG1/ErbB4信号是否具有类似增强GABA能突触传递的作用。同时，大量的证据显示GABA能抑制水平的高低可以调制LTP的诱导，提高GABA能抑制可以减弱LTP的诱导，阻断或减弱GABA能抑制则可以增强LTP的诱导。　　 根据上述的研究结果我们提出一个假说：NRG1有可能通过改变GABA能突触传递水平的高低来调制兴奋性突触的可塑性，既NRG1提高了海马的GABA释放，这种GABA能抑制的增强抑制了海马CA1区LTP诱导。我们主要通过电生理和药理学的方法做了下面一系列的实验来验证这个假说。我们首先运用细胞外方法记录成年小鼠海马脑片Schaffer-CA1突触的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentiation，fEPSP)来观察NRG1对强直(tetanus)刺激诱导的LTP的作用，并且通过改变GABA能抑制水平来观察GABA能抑制是否在NRG1对海马LTP的调制中发挥的作用，最后用膜片钳的全细胞记录方法直接观察NRG1对CA1海马锥体神经元的GABAA受体介导的电流的影响。　　 主要研究结果如下：　　 首先，在高频强直刺激(100HZ)诱导前20分钟灌流给予NRG1(1，2 nM)观察NRG1对基本突触传递和LTP的诱导的影响。对于每一个脑片，将强直刺激前15 min fEPSP斜率的均值为基准值(100％)，强直刺激后60 min内fEPSP斜率的均值用相对于基准值的百分比表示。研究结果表明脑片灌流1 nM NRG1不影响基本突触传递也不影响双脉冲易化，然而灌流1 nM和2 nM NRG1可以明显抑制海马Sehaffer-CA1突触LTP的诱导：对照组诱导后斜率为154.80±6.12％(n=10)，加入1nM NRG1组诱导后fEPSPs的斜率为113.31±5.52％(n=9)，加入2 nM NRG1组诱导后fEPSP的斜率为120.37±5.27％(n=7)；三组差别具有统计学意义(P<0.01，one way ANOVA)与对照组相比，1 nMNRG1组和2nM NRG1组斜率(P<0.01，one way ANOVA，LSD)低于对照组，有统计学意义；1 nM和2 nM NRG1组之间斜率差别无统计学意义(P>0.05，one wayANOVA，LSD)，提示NRG1对LTP的抑制作用在1 nM浓度已达到饱和。这些结果表明给予外源性的NRG1可以明显抑制海马Schaffer-CA1突触LTP的诱导。ErbB4是NRG1的功能性受体，并且在海马CA1区高表达，为了检验NRG1是否通过作用于ErbB4受体抑制了LTP的诱导，我们应用AG1478(5μM)阻断ErbB4受体后再检测NRG1对LTP的影响(AG1478可以阻止ErbB4受体自身的磷酸化反应，是一种有效的可透膜ErbB4受体激酶拮抗剂)。结果表明AG1478阻断了NRG1对LTP诱导的抑制作用：在存在AG1478(5μM)情况下，对照组诱导后斜率为165.79±6.17％(n=9)，加入1 nM NRG1组诱导后fEPSPs的斜率为175.20±16.70％(n=5)，两组之间无统计学差异(p>0.05，两样本t检验)。另外，我们在高频刺激后20min灌流给予NRG1(1 nM)观察NRG1对LTP表达的影响。研究结果表明：高频刺激诱导LTP后灌流NRG1(1nM)40min平均斜率为143.79±7.67(n=6)，对照组144.95±6.34(n=7)，两组之间相比无统计学差异(P>0.05，两样本t检验)。上述结果表明急性给与外源性的NRG1可以明显抑制海马Schaffer-CA1突触LTP的诱导，而不影响LTP表达。　　 其次，为了观察GABA介导的抑制是否参与了NRG1对LTP诱导的抑制，我们应用了不同浓度GABAA受体的特异性阻断剂荷包牡丹碱(bicuculline，BMI)以阻断GABAA受体介导的抑制，深入观察各个浓度下NRG1对LTP的作用。研究结果表明荷包牡丹碱对于NRG1抑制LTP诱导有阻断作用，并且呈浓度依赖性的方式：在存在5μM BMI情况下，对照组诱导后fEPSPs的斜率是173.35±9.64％(n=7)，加入NRG1(InM)组诱导后fEPSPs的斜率是138.61±11.11％(n=6)，NRG1组fEPSP的斜率小于对照组，仍然有统计学差异(P<0.05，两样本t检验)；在存在10μM BMI情况下，对照组诱导后fEPSPs的斜率是176.56±5.96％(n=8)，加入NRGI(1 nM)组诱导后fEPSPs的斜率是160.11±14.62％(n=7)，虽然NRG1组fEPSP的斜率小于对照组，但是无统计学差异(P>0.05，两样本t检验)；在存在20μM BMI情况下，对照组诱导后fEPSPs的斜率是180.22±9.26％(n=6)，加入NRG1(1 nM)组诱导后fEPSPs的斜率是182.16±6.30％(n=7)，两组之间差异无统计学意义(P>0.05，两样本t检验)。结果表明5μM BMI不影响NRG1对LTP诱导的抑制作用，10μM BMI可部分取消NRG1对LTP诱导的抑制作用，而20μM BMI可以完全取消NRG1对LTP诱导的抑制作用。为了进一步证明BMI的这种作用是由于阻断GABAA受体实现的，我们观察了另一种GABAA受体阻断剂印防己毒素(picrotoxinin，PTX)的作用：在存在100μMPTX，对照组诱导后fEPSP的斜率是168.56±12.5％(n=7)，加入NRG1(1 nM)组诱导后fEPSPs的斜率是168.64±14.48％(n=6)，两组均数之间无明显差异。上述结果表明GABAA受体阻断剂可以浓度依赖性的取消NRG1对LTP诱导的抑制作用，从而提示GABAA受体介导的抑制参与了由NRG1对LTP诱导的抑制作用。　　 第三，为了确定内源性NRG1对于LTP的影响，我们合成了Ecto-ErbB4。它与FC片段相连，包含了完整的ErbB4的胞外段。Ecto-ErbB4可与NRG1结合，阻止NRG1与ErbB4受体的作用。结果表明，应用Ecto-ErbB4增强了由强直刺激诱导的LTP：对照组诱导后fEPSP的斜率是154.95±4.07％(n=7)，加入Ecto-ErbB4(1μg/ml)组诱导后fEPSPs的斜率是188.12±10.12％(n=5)，两组之间差异有统计学意义(P<0.05，两样本t检验)。从而提示内源性和外源性NRG1对于LTP具有一致的调节作用。我们上述的结果已经提示GABAA受体介导的抑制参与了由外源性NRG1对LTP诱导的抑制作用，为了更进一步证明内源性NRG1对LTP的调制是否通过GABAA受体介导的抑制实现的，我们比较了阻断GABAA受体和阻断ErbB4受体对LTP诱导作用的影响，以及阻断GABAA受体与阻断ErbB4受体是否存在协同作用。　　 我们比较了空白对照组、AG1478组(5μM)、BMI组(20μM)和AG148+BMI组(20μM BMI+5μM AG1478)(由于AG1478由DMSO配制，DMSO终浓度均为0.05％，为了排除DMSO的对结果的影响，空白对照组和BMI组均加入DMSO，终浓度为0.05％)。研究结果：空白对照组fEPSP的斜率是140.41±4.08％(n=8)，AG1478组fEPSP的斜率为165.79±6.17％(n=9)，BMI组的斜率为177.96±8.40％(n=6)，AG1478+BMI组的斜率为182.03±13.53％(n=6)。统计学结果表明，四组斜率的差别具有统计学意义(F=5.608，P<0.01，one wayANOVA)，与空白对照组相比，AG1478组(P<0.05)、BMI组(P<0.01)和AG148+BMI组(P<0.01)的斜率均明显增加(one way ANOVA，LSD)；AG1478组、BMI组和AG148+BMI组三者之间的斜率差异均无统计学意义(P>0.05)。这些结果表明阻断ErbB4受体和阻断GABAA受体都能够增强对LTP诱导，两者的增强作用无统计学差异；并且，AG1478组、BMI组和AG148+BMI组三者之间的斜率无显著性差异表明AG1478组与BMI组没有协同增强LTP诱导的作用。这些结果进一步提示阻断内源性ErbB4受体可以增强LTP的诱导；AG1478组与BMI组没有协同增强LTP诱导的作用，则说明两者的增强作用可能具有相同机制，既阻断ErbB4受体能够增强LTP诱导可能是由于减弱了GABA能抑制实现的。上述结果更进一步说明NRG1/ErbB4是通过改变GABAA受体介导的抑制来调节LTP诱导。　　 最后，我们通过膜片钳全细胞记录技术直接观察NRG1对成年小鼠海马脑片CA1区锥体神经元GABAA受体介导电流的影响。对于每一例细胞，所测量的电流以用药前的均值为基准值(100％)，用药后结果用相对于基准值的百分比表示。研究结果：(1)我们发现NGR1可以增强成年小鼠海马脑片CA1区锥体神经元诱发的抑制性突触后电流(evoked inhibitory postsynaptic current，IPSC)：给予NRG1后10min(n=11)，幅度为131.82±6.238％(P<0.01，配对t检验)。作为对照，去活性的NRG1(n=4)或Vehicle(n=6)没有引起IPSC的幅度的变化：加入去活性的NRG1的IPSC平均幅度为95.34±7.42％(P>0.05，配对t检验)，加入0.01％BSA平均幅度为103.24±8.56％(P>0.05，配对t检验)。这些结果表明在成年小鼠的海马脑片CA1锥体神经元，急性给予NRG1可以增强GABA介导的抑制性突触电流.(2)灌流给予NRG1(1nM)可以增加成年小鼠海马脑片CA1区锥体神经元GABA能自发微小突触后抑制性电流(mIPSC)的频率但却没有影响幅度(n=8)：灌流NRG1后10min，mIPSC的平均频率变为126.84±10.72％(P<0.05，配对t检验)，mIPSC的平均幅度为105.41±4.90％(P>0.05，配对t检验)。作为对照，给予去活性的NRG1(n=4)或Vehicle(n=6)均没有引起mIPSC的幅度或频率的变化：加入去活性的NRG1频率104.48±5.87％(P>0.05，配对t检验)，幅度103.20±1.69％(P>0.05，配对t检验)：加入0.01％BSA频率为99.80±8.07％(P>0.05，配对t检验)，幅度100.22±4.62％(P>0.05，配对t检验)。NRG1增加mIPSC的频率而不影响幅度提示了NRG1可能作用于突触前位点。(3)为了进一步确定NRG1是否增加了GABA突触前释放，我们检测了灌流NRG1前后IPSC的PPR的变化，结果表明灌流NRG(1nM)可以减少IPSC的PPR：从灌流NRG1前1.93±0.23到灌流后10-15分钟1.36±0.13，1.32±0.12，该作用可被洗脱(n=8，P<0.05，配对t检验)。作为对照，给予去活性的NRG1没有影响PPR的变化(n=5，P>0.05，配对t检验)。上述结果表明NRG1可以增加GABA突触前释放。　　 上述研究结果提示NRG1/ErbB4信号通路通过增强了GABA释放导致了成年海马脑片上LTP诱导的抑制，接下来我们将应用转基因动物和分子生物学手段进一步阐明NRG1/ErbB4信号通路在成年海马这种作用，它使我们能够更加深入了解NRG1在GhBA能突触调节中的作用和它在成年大脑的功能及其分子细胞机制；有助于理解精神分裂症患者的工作记忆障碍等认知缺陷的病理机制，并且为开发新型的功能性药理干预措施提供一个合理的依据。