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目的选择性剪接与人类疾病密切相关,在急性早幼粒白血病中,L型PML-RARα融合基因也经历了这一过程。本研究拟从PML-RARα融合基因不同剪接体与急性早幼粒白血病(APL)患者预后关系这一临床探讨入手,进而在具有此三种剪接体的NB4细胞水平验证临床实验结论,再通过外源基因转入实验证实PML-RARαL型融合基因不同选择性剪接体可影响细胞对维甲酸诱导分化的敏感性,并从亚细胞定位及分化的角度探讨其分子机理。除此之外,我们还将证明PML-RARαL型融合基因的不同剪接异构体比例的变化是否与剪接因子ASF/SF2、hnRNP A1蛋白表达水平有关,探索从选择性剪接角度寻找提高细胞对维甲酸敏感性的途径,为进一步提高APL缓解率提供新的思路。方法1、PCR法检测APL患者PML-RARαL型融合基因三种剪接异构体表达水平采用RT-PCR方法检测死亡组(9例)与CR1组(66例)PML-RARα融合基因表达,用UVP凝胶成像分析系统对有三种剪接体即E5(+)E6(+)(第5外显子和第6外显子均存在),E5(-)E6(+)(第5外显子缺失)和E5(-)E6(-)(第5外显子和第6外显子均缺失)进行灰度扫描,计算各剪接体相对表达量;对各剪接体相对表达量、初发时外周血白细胞数及年龄分别进行多因素预后分析。2、采用荧光定量PCR法对NB4细胞内源性的三种剪接异构体相对表达量进行检测制备PML-RARαL型融合基因各剪接体及内参ABL基因的阳性标准品及探针,建立荧光定量PCR检测体系。检测1μM ATRA诱导NB4细胞分化过程中0-96h不同时间点,各剪接异构体相对表达量的变化,观察不同剪接体对ATRA诱导作用的敏感性是否不同。同时行细胞形态学观察、流式细胞术、NBT还原实验判断细胞分化。3、构建PML-RARα融合基因三种剪接异构体的真核表达载体扩增有三种剪接体全长ORF区域,分别构建真核表达载体pEGFP-N3-E5(+)E6(+)、pEGFP-N3-E5(-)E6(+)和pEGFP-N3-E5(-)E6(-),分别利用脂质体瞬时转染293T细胞,48h后在共聚焦显微镜下观察三种融合蛋白的亚细胞定位。4、构建PML-RARα融合基因三种剪接异构体的慢病毒表达体系采用1:4:1:1的最佳比例将构建成功的各表达质粒pCDH1-E5(+)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)分别与包装辅助质粒pPACKH1-GAG , pPACKH1-REV和pVSV-G共转染293T细胞,包装病毒颗粒,浓缩后进行滴度测定,感染U937细胞,有限稀释法筛选单克隆细胞。5、荧光定量PCR法检测ATRA诱导各克隆细胞分化过程中剪接异构体的表达量变化1μM ATRA诱导U937细胞分化,细胞形态学观察、流式细胞检测表面抗原作为判断分化的指标,在0-96h五个不同时间点,采用荧光定量PCR检测各剪接体相对表达量,进一步验证不同剪接体对ATRA诱导作用的敏感性。6、剪接因子hnRNP A1、ASF/SF2表达水平与L型PML-RARα融合基因选择性剪接的相关性研究提取各肿瘤细胞系NB4,K562, U973及293T等细胞总蛋白,通过western blot检测细胞中hnRNP A1、ASF/SF2基因表达水平;将APL患者中,依E5(-)E6(-)表达量高低分为两组进行剪接因子表达水平检测,进一步比较分析二者间的相关性。以ASF/SF2与hnRNP A1表达量的比值作为剪接因子表达水平。结果1、PML/RARαL型融合基因选择性剪接与APL患者预后关系研究死亡组与第1次完全缓解组各剪接体表达量差异均有统计学意义(分别为P=0.005,P=0.000和P=0.000),两组初发白细胞数及年龄与预后无明显相关性(P值分别为0.219与0.086),Logistic回归多因素预后分析示E5(-)E6(-)相对表达量与预后最为相关,且为负相关(B=-13.490,P=0.001),即E5(-)E6(-)相对表达量高的APL患者预后差。2、在ATRA诱导分化过程中NB4细胞内源性的三种剪接异构体相对表达量变化ATRA作用于NB4细胞后,细胞形态学出现了明显的分化趋势,NBT阳性率及CD11b CD33阳性率随着药物作用时间的延长而递增。荧光定量PCR结果表明:随着时间的延长, E6(+)与E5(-)E6(-)剪接体相对表达量均呈逐渐下降趋势,除0h外与对照组相比的各个时间点均有显著的差异(P<0.05)。且E6(+)剪接体较E5(-)E6(-)相对表达量下降出现的较早,两者下降幅度在各个时间点均不同,经统计分析,在24h,48h,72h,96h均有显著的差异(P<0.05)。3、亚细胞定位研究经酶切、测序鉴定,真核表达载体pEGFP-N3-E5(+)E6(+)、pEGFP-N3-E5(-)E6(+)和pEGFP-N3-E5(-)E6(-)构建成功。瞬时转染293T细胞后,激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位,结果显示:转染pEGFP-N3-E5(-)E6(-)的细胞中融合蛋白呈聚集状分布于细胞浆内,细胞核无表达,而分别转有pEGFP-N3-E5(+)E6(+)和pEGFP-N3-E5(-)E6(+)的两种细胞内融合蛋白均呈弥散状分布于胞浆与胞核区域。4、慢病毒表达体系构建利用基因组工程技术构建空载体与三种剪接异构体的pCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒表达体系,经酶切,测序,滴度及感染效率测定及PCR扩增与Western blot鉴定,说明pCDH1,pCDH1-E5(+)E6(+),pCDH1-E5(-)E6(+)和pCDH1-E5(-)E6(-)四种慢病毒表达体系成功构建。5、ATRA诱导各克隆细胞分化过程中剪接异构体表达量变化研究实验结果显示:随着ATRA药物作用时间的增加,pCDH1-E5(+)E6(+),pCDH1-E5(-)E6(+)与pCDH1-E5(-)E6(-)组剪接体相对表达量均呈逐渐下降趋势,且与0h相比,24h-96h时间点均有显著性差异(P<0.05)。在同一时间点,与0h相比三组剪接体相对表达量下降幅度明显不同,pCDH1-E5(+)E6(+)组下降幅度最大,pCDH1-E5(-)E6(+)组次之,而pCDH1-E5(-)E6(-)组下降为最小。其下降程度经统计分析,pCDH1-E5(-)E6(-)组在24h,48h,72h,96h与其它两组均有显著的差异(P<0.05),pCDH1-E5(-)E6(+)组和pCDH1-E5(+)E6(+)组在24h、48h有差异(P<0.05),到72h,96h时则无显著差异(P>0.05)。6、剪接因子hnRNP A1、ASF/SF2表达水平与L型PML-RARα融合基因选择性剪接的相关性研究对不同肿瘤系细胞研究表明:不同细胞系剪接因子表达水平不同。CR1组与死亡组剪接因子表达水平有显著差异(P<0.05)。其中CR1组部分病例体内存在hnRNP A1表达缺失。结论1、初发时PML-RARαL型融合基因E5(-)E6(-)剪接体表达量较高的APL患者其预后差。2、在细胞水平证实了E5(-)E6(-)较E6(+)剪接体对ATRA诱导分化作用的敏感性差。3、剪接体E5(-)E6(-)失去核定位信号导致的胞浆滞留是其对ATRA诱导分化不敏感的分子机制之一。4、分别成功构建了PML-RARαL型融合基因三种剪接体的慢病毒表达体系,从单一剪接体的角度证明了剪接体E5(-)E6(-)较E5(-)E6(+)、E5(+)E6(+)对ATRA敏感性差。5、PML-RARαL型融合基因三种剪接体表达比例与剪接因子hnRNP A1、ASF/SF2有密切的相关性。