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睾丸Leydig细胞合成和分泌雄激素，其主要反应途径是：胆固醇 胆固醇侧链裂解酶（P450scc） 孕烯醇酮 3β-羟甾脱氢酶（3βHSD） 孕酮 17α-羟化酶（P450c17） 17-羟孕酮 P450c17 雄烯二酮 17-羟甾脱氢酶（17βHSD） 睾酮。在这一过程中，4种睾酮生成酶的作用非常重要，它们的表达量直接影响到Leydig细胞的睾酮合成量。在机体中，辜酮生成酶的表达受到多种因素在多个水平的调节，近年来有研究发现类固醇生成因子-1（steroidogenic factor 1，SF-1）也可能调节睾酮生成酶的表达，影响睾酮合成。SF-1属于核受体蛋白，1992年首先由Lala等从牛肾上腺细胞核提取物及鼠肾上腺细胞核提取物中纯化得到。通过对一些睾酮生成酶基因的序列分析，发现牛和鼠类P450scc、P450c17基因以及人Ⅱ型3βHSD基因的5’端转录起始点上游均存在SF-1的结合位点，诱导这些位点突变导致目的基因转录水平下降，或使得它们对hCG的反应性下降，提示SF-1可能和这些睾酮生成酶的转录调节有关，影响睾酮合成。然而，目前只有资料间接显示胚胎期SF-1与睾丸雄激素生成具有相关性，本研究目的旨在直接阐述青春期SF-1对睾酮生成的调节作用。 实验共分三个部分进行：第一部分探讨青春期小鼠睾丸组织是否有SF-1表达以及它与睾酮生成酶的表达是否具有相关性；第二部分在证实青春期睾丸SF-1与睾酮生成酶表达具有相关性的基础上，进一步检测SF-1是否在青春期睾丸Leydig细胞有表达，从形态学方面证实SF-1对睾酮生成的调节作用；第三部分在确定SF-1在青春期Leydig细胞中表达的基础上，进一步直概研究Leydig细胞中SF-1对睾酮生成酶表达以及睾酮合成的调节作用。 南京医科大学硕士学位论文 第啼分：青糊小鼠睾丸中SF《与睾酮生成酶InRNA M的相关性研究 运用半定量盯平CR方法，分别测定了 5天、2 0天和 3 0天。J。鼠睾丸组织中SF一1及P450scc、P450c17、30HSD、170HSD的mRNA水平，结果显示：5天小鼠性腺功能仍未成熟；睾丸中肝＜：RNA水平毗；2 0 k，1、鼠开kbil？LN青春期发育，睾丸中辟八 水平驯上升，但与5天小鼠相大无明显差异（P＞0．05），与此同时P450SCC mRNA水平也升高；3 0天小鼠个步发育成熟，睾丸 SF叶 水平进一步增高，与 5天，J、鼠相比有显著差异u北．05）；k匕时P45肿cc mRNA的水平也达多高峰，与 5天小鼠相比有显著差异汀刎．05）。提示SF叶与 P45kCCmRNA的水平呈正相关变化。＆ SF－lmRNA水平与 P450c17、36HSD、17即SD mRNA水平之间朋相关性。这一结肌分子水平间蝴示了SF叶与青春期睾酮生成之间的相关性，它可能参与调节P450北c的转录，影响睾酮的合成。 第二部分：青春期小鼠睾丸中SF＜的表达 运用免疫组化的方法，测定了 5天、2 0天和 3 0天，J、鼠睾丸中”＜的表达，结果显示：5天小鼠Leydg细胞属于未成熟型，分泌的雄激素水平毗，细触中未见SF上表达；20天小鼠进入青春期，30天小鼠进一步发育成熟，它们的 Leydig细胞驯发育为成熟型，分雌激素，f则嫡中耶－1大量表达。由此可见，SFl在Lcydig细胞中的表达与细胞的功能发育及激素生成水平相一致，进一步帅态学方面证实了 SF＜可能参与调节青春期睾酮的生成。同时，实鞭显示：5天小鼠睾丸曲细精管仍为实。C细胞索，只有A型桶细胞和未成熟型Sertoli细胞，此时 S咖li细胞中有盯4表达，6 A型精原细胞未见SF－l表达；20、30 A，J、鼠曲细精管开kb出现管腔，S咖h细胞转化为成熟型；SFq表达消失。生精细胞同时帐育分化，开始出现B型精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞等各级生精细胞，SF 4在B型舶细帆细线期、偶线期、粗线期初级精母细B咙中表达。这一结果揭示了 SF叶在精子发生腑中顺的作用，尤其在 B 2 南京医科大学硕士学位论文型舶细胞向初级精母细胞洲以及初蝴母细胞的第一次成熟分裂隙中起重抓用，它可能对一些与精子发生相关的基固姊调节作用。 第三部分：青釉小鼠睾丸中的叶对N 5 os CC及 3耶D的调节作用 分离青春期小鼠睾丸 LCydig细胞，槽以体内环境，建立体外培养细胞的方法，在培养眯中加入 hCG刺激，测定细胞的睾酮分泌量及细胞内 P45帖CC和36HSD mRNA水平。结果显示：在LH／hG作用下，培养的 Leydig细胞内 P450scc和 VI型邓HSD mRNA表棚加，促进睾酮合成，这一结果与体内情况相符合。 在此实验基础上，将SF＋的反义躺替酸转染进入培养的Leydig细胞，阻断SF＜蛋白质的表达，测定细胞的睾酮分泌量及细胞内P450SCC和30HSDtnRN水平。结果显示：反义SF4＋hCG作用组的睾酮含量与空白组相比无显著差异，却明显低于正义SF地CG组及hCG作用组，提示比G对睾SNob＆．的刺邮用翩于辟l的存在，