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1研究目的中药质量控制通过质量标准实现的,因此,揭示其确切疗效的质量内涵是现代中药研究的战略性问题。为了探讨中药质量标准的研究方法,实现质量标准能够标识中药有效性、安全性和稳定性这三个关键性指标,我们选用临床验方鼻康喷雾剂为研究载体,在确定其治疗鼻鼽(变应性鼻炎,Allergic rhinitis,AR)相关的生物效应的基础上,探讨其药效组分及其品质评价的生物效应鉴定方法。2研究内容与方法本研究共分为三大部分,即鼻康喷雾剂治疗AR的生物效应的确定、鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分分析、鼻康喷雾剂治疗AR生物效应鉴定指标的确定。2.1鼻康喷雾剂治疗AR生物效应的确定采用现代药理学抗炎、抗过敏等实验方法确定鼻康喷雾剂治疗AR的生物效应,以探讨该生物效应所对应的药效组分,从而确定有效性鉴定指标。生物效应的实验内容包括:鼻康喷雾剂对小鼠耳廓二甲苯致炎的影响;对大鼠蛋清足跖肿胀的影响;对大鼠棉球肉芽肿的影响;对大鼠被动皮肤过敏反应的影响;对小鼠红细胞免疫功能的影响。2.2鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分分析采用高效液相色谱法。色谱条件:Agilent1100 HPLC,Hypersil ODS色谱柱(25μm,4.6mm×250mm),乙腈-0.3%十二烷基硫酸钠的水(0.1%磷酸、0.3%三乙胺)(40:60)为流动相,检测波长210nm,流速1.0mL/min,室温。以此色谱条件,测定鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分的含量。2.3鼻康喷雾剂治疗AR生物效应鉴定指标的确定以卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)鼻腔攻击诱导建立AR的动物模型,通过行为学评分、病理学观察以及鼻黏膜中组胺的含量指示模型的可用性。采用鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分标准物质以及三批鼻康喷雾剂进行治疗,用ELISA法测定AR动物模型血清中白细胞介素-4 (IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)两个指标。3研究结果3.1鼻康喷雾剂治疗AR的生物效应的确定3.1.1鼻康喷雾剂对小鼠耳廓二甲苯致炎的影响鼻康喷雾剂阴性对照组小鼠耳廓肿胀度12.05±1.52 mg,鼻康喷雾剂大、中、小剂量组小鼠耳廓肿胀度分别为3.42±3.32 mg、5.95±2.04 mg、10.30±1.75 mg,与阴性对照组比较有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。实验结果表明,鼻康喷雾剂能够减轻二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀度,说明其具有抗炎的作用。3.1.2鼻康喷雾剂对大鼠蛋清足跖肿胀的影响鼻康喷雾剂大、中、小剂量组在致炎后2h时大鼠右后足跖肿胀度明显减小,4~6h时作用最为明显,与阴性对照组比较有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。实验结果表明,鼻康喷雾剂能够减轻蛋清所致的大鼠右后足跖肿胀度,说明其具有抗炎的作用。3.1.3鼻康喷雾剂对大鼠棉球肉芽肿的影响阴性对照组大鼠肉芽肿重量为224.99±83.09 mg/100g体重,鼻康喷雾剂大、中、小剂量组大鼠肉芽肿重量分别为144.61±25.82 mg/100g体重、163.78±21.49 mg/100g体重、210.42±69.60 mg/100g体重,与阴性对照组比较明显减小(P <0.05)。实验结果表明,鼻康喷雾剂能够对大鼠棉球肉芽组织增生有抑制作用,说明其具有抗炎的作用。3.1.4鼻康喷雾剂对大鼠被动皮肤过敏反应的影响阴性对照组光密度(OD值)分别为0.32±0.13和0.26±0.06,鼻康喷雾剂大、中剂量组OD值分别为0.19±0.11和0.15±0.09、0.25±0.12和0.19±0.09,与阴性对照组比较有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。实验结果表明,鼻康喷雾剂对大鼠同种被动皮肤过敏反应引起的血管通透性增加有抑制作用,说明其具有抗过敏作用。3.1.5鼻康喷雾剂对小鼠红细胞免疫功能的影响鼻康喷雾剂能提高小鼠红细胞C3b受体花环率(Red Blood Cell-C3b Receptor Rosette, RBC-C3bRR) ,中剂量组和大剂量组与阴性对照组比较有显著性差异(P <0.01) ;能降低(Red Blood Cell-Immune Complex Rosette, RBC-ICR) ,中剂量组和大剂量组与阴性对照组比较有显著性差异(P <0.01)。实验结果表明,鼻康喷雾剂能够提高小鼠红细胞C3b受体(Red Blood Cell-C3b Receptor, RBC-C3bR)的数量和活性,降低循环免疫复合物(Immune Complex, IC)的数量,从而可有效地提高小鼠红细胞的免疫功能,说明其具有免疫调节作用。3.2鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分分析鼻康喷雾剂中药效组分A和B分别为9.8404mg/mL和8.7506mg/mL。3.3鼻康喷雾剂治疗AR生物效应鉴定指标的确定3.3.1 AR生物效应纯指标实验模型研究通过行为学的考察、病理形态的观察以及鼻黏膜组织组胺含量的测定,结果表明,模型组与正常组以及治疗组有明显的差异,确定该方法能够成功的制作AR的模型。3.3.2鼻康喷雾剂及其药效组分对AR动物模型的影响药效组分治疗组可以将模型动物血清中IL-4含量从100.40±15.27 pg/mL降低至78.88±14.01 pg/mL,三批鼻康喷雾剂可以分别将含量降低至82.27±15.63 pg/mL、81.07±10.61 pg/mL、79.75±12.77 pg/mL,并且药效组分治疗组与三批鼻康喷雾剂比较并无显著性差异(P <0.05或P <0.01)。药效组分治疗组可以将模型动物血清中INF-γ含量从56.24±13.58 pg/mL提高至80.26±19.06 pg/mL,三批鼻康喷雾剂可以分别将含量提高至77.71±9.67 pg/mL、75.91±18.62 pg/mL、73.36±15.91 pg/mL,并且药效组分治疗组与三批鼻康喷雾剂比较并无显著性差异(P <0.05或P <0.01)。4结论4.1鼻康喷雾剂具有抗炎、抗过敏以及免疫调节作用,表明鼻康喷雾剂具有治疗AR的生物效应。4.2通过对模型动物血清中IL-4、INF-γ两个生物效应指标测定,证明即确定的鼻康喷雾剂药效组分与原处方药具有等效性。4.3鼻康喷雾剂治疗AR的品质评价方法与指标4.3.1生物效应鉴定法采用纯指标鉴定法。鉴定指标为:OVA鼻腔诱导的AR模型Balb/c小鼠组细胞因子IL-4和INF-γ的含量,IL-4含量变化区间为100.40±15.27 pg/mL～78.88±14.01 pg/mL;INF-γ含量变化区间为56.24±13.58 pg/mL～80.26±19.06 pg/mL。4.3.2药效组分鉴定法采用HPLC方法测定。鉴定指标:药效组分A-B,A-B = 1:0.9。5创新点首次确定鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分为A-B = 1:0.9;首次探索利用鼻康喷雾剂治疗AR的药效组分和生物效应的单纯指标法评价鼻康喷雾剂的品质。