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为了解我国石油污染土壤现状以及石油污染对土壤理化性质、微生物的影响,并在此基础上对石油污染土壤进行生物修复,本文开展了以下几方面的研究工作:(1)根据油田的产量以及地理位置,对国内的大庆、胜利、江汉以及江苏油田油井周边石油污染土壤以及部分油田油泥污染现状进行了初步调查;(2)选择了代表性石油污染土壤,研究了石油污染后土壤理化性质、生物学毒性、微生物多样性等的变化,综合评价了石油污染对土壤质量的影响;(3)分离并富集了具有降解石油能力的菌株或菌群,并在此基础上研究了其对不同来源石油的降解能力;(4)通过对石油降解菌(菌群)发酵培养条件优化,选择吸附剂制成了修复菌剂:(5)通过微域试验,研究了菌剂以及营养物质、土壤改性措施对石油污染土壤修复效率的影响,并在此基础上开展了中试规模油田污染油泥的实际修复研究工作。
本研究的主要结果总结如下:
(1)通过对大庆、胜利、江汉以及江苏油田油井周边土壤以及胜利油田滨一污水处理厂油泥的初步调查,发现地处北方的胜利、大庆两大油田在油井周围100m范围内所采集的土壤中油含量大多数高于临界值:油田的接转站、联合站的油罐、沉降罐、污水罐产生的油泥以及隔油池的底泥也会产生大量的油泥从而污染土壤。土壤受石油污染后使土壤有机质显著增加、而对全氮、水解氮、有效磷、速效钾、pH等无显著影响。对于污染土壤自修复来说,土壤中N、P严重缺乏。所以,在进行石油污染土壤修复时需要补充适量N、P营养元素,以增强土壤中微生物的活性,从而加快石油的分解。
(2)采用常规的土壤理化分析、微生物培养法、碳素利用法(Biolog)和发光细菌生物毒性等新兴微生态研究方法,研究了石油污染引起的土壤理化性质和功能多样性等微生物生态的变化。结果表明,石油污染使该土壤有机质含量增加,pH降低,而对土壤其他理化性质无显著影响。平板计数显示石油污染对该土壤中的细菌总量没有显著影响,但污染土壤中总烃降解菌数和芳烃降解菌数增加了几个数量级。Biolog的研究表明石油污染导致土壤中多种多样性指数增加,说明石油污染刺激了土壤中微生物的生长,使土壤中微生物多样性增加。而生物毒性试验表明清洁土壤对发光细菌没有毒性,而石油污染土壤对发光细菌发光具有抑制作用,其EC50为1950μgml-1。
(3)以原油为唯一碳源,经过BH培养基富集培养,通过血平板从不同石油污染土壤中分离纯化获得多株细菌。测定这些细菌对柴油的乳化程度,发现菌株X13-1具有较强乳化能力,其1h、24h的乳化率分别为80%和75%,明显高于文献报道。此外,该菌在以石蜡为唯一碳源的BH培养基中生长较好,说明其具有较强的分解石油的能力。经过Biolog细菌自动鉴定仪鉴定,同时进一步通过PCR扩增获得该菌的16S rDNA并测序。对其16S rDNA序列分析表明,该菌株与GenBank中的醋酸钙不动杆菌同源性为97%,确定该菌可能为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。另外,经过6个月的富集,从不同石油污染的土壤中得到五个石油降解菌群,其中菌群14具有最强的石油降解能力。通过菌群14对不同来源的四种原油即江汉、胜利、西江、南阳原油进行了降解试验,发现所有样品中饱和烃较芳香烃更易降解,菌群14对四种石油的降解程度为江汉>西江>南阳>胜利。此外,分析原油的性质与降解率的关系可以看出,菌群对原油的降解率与原油的APIo成正相关,与原油的粘度成负相关。
(4)在对石油污染土壤理化性质和土壤微生物研究的基础上,通过接种石油降解菌剂、添加营养、定期翻动以及栽种植物等方式对两种石油污染土壤进行了修复。试验表明添加氮磷等营养元素后土壤中烃降解菌明显增加,石油降解速率显著加快。对于受石油污染时间较长的潮土在本试验中接种烃降解菌剂对石油降解率没有显著影响。但对新添加石油的红壤,由于土壤中烃降解菌少,故添加菌剂明显促进了石油降解。在修复试验进行到120d后,在潮土的处理4(营养+接种),处理5(营养+接种+柠檬酸钠)中分别播种狼尾草和紫花苜蓿。栽种植物后,在根际效应的影响下,土壤中石油降解速率显著加快,生物毒性明显降低。另外对试验结束后潮土的处理1(对照处理),处理3(营养处理),以及处理4,5土壤中总DNA进行提取和基于16SrDNA V3区进行了PCR—DGGE研究,结果表明经过修复处理改变了土壤中优势细菌的群落结构,使土壤细菌多样性增强。
(5)在微域试验基础上,通过添加含氮磷丰富的有机肥以及黄沙、锯末等调理剂和接种烃降解菌等方式进行了年处理1300吨油泥的预制床修复。结果表明添加5%的有机肥后,油泥中氮、磷等营养物以及烃降解菌含量显著增加。经过160d的修复,不同处理油泥中的油含量均有明显下降,其中处理A中降解率最高,高达52.75%,而对照处理的降解率仅为15.46%。其中有机肥的加入和搭建大棚对油的降解率有显著影响(p<0.05),而调理剂和菌剂的作用暂不显著。在研究油泥中油的降解率的同时,对修复后各处理的油泥中微生物多样性以及生物毒性进行了研究。结果表明修复措施增强了油泥中微生物的活性和多样性。不同修复处理的各项多样性指数相对于对照处理的均有极显著增加(p<0.01)。在几个处理中,除处理A(油泥+锯末+黄沙+菌剂+大棚)的生物毒性增加外,其余处理的生物毒性均有所降低。