目的：探寻高尔基体α甘露糖苷酶I (Golgi M I)介导的HBV(乙型肝炎病毒)的去甘露糖修饰,是否能使病毒逃逸树突状细胞(DCs)表面DC-SIGN的免疫识别及其机制。将DC-SIGN基因沉默后,观察DCs在野生型HBV或高甘露糖型HBV刺激下的免疫指标,研究野生型HBV与高甘露糖型HBV对DC的成熟和免疫活化的影响,以及DC-SIGN在HBV感染中发挥的免疫作用。在课题组既往实验的基础上,通过寻找可能存在于HBe功能蛋白基因序列中的促进宿主细胞Golgi M I活性的核心片段,来初步探讨Golgi M I相关的HBV去甘露糖修饰,通过何种机制逃逸DC-SIGN对HBV的免疫识别及阻碍DCs免疫活化。方法：一、树突状细胞DC-SIGN的基因沉默及其对树突状细胞免疫功能的影响1.分离健康人的外周血单个核细胞(PBMC)进行体外培养,以GM-CSF、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)将其诱导分化为DC；2.构建DC-SIGN基因沉默的siRNA序列,分组转染DC细胞；3. RT-PCR法检测DC细胞内DC-SIGNmRNA的表达,流式细胞术检测DC细胞表面DC-SIGN的表达,选择DC-SIGN沉默效果最好的序列进行后续试验；4.空白对照组、DC-SIGN基因沉默组与转染无关siRNA序列组的DC细胞,以流式细胞术检测表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表达;5. ELISA法检测4中所述三组DC细胞分泌细胞因子IL-10与IL-12p70的水平；6.MTT法检测4中所述三组DC细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；7. Westernblot法检测4中所述三组DC细胞内NF-κB p65与p38的表达；二、野生型与高甘露糖型HBV对DC-SIGN基因非沉默与沉默的树突状细胞免疫功能的影响1.体外培养HepG2.2.15细胞；2.加入基夫碱母液至HepG2.2.15细胞中,使基夫碱终浓度为5ug/ml,如此处理5天后收集HepG2.2.15培养上清液；3.通过低温超速离心法,从基夫碱处理的HepG2.2.15细胞提取获得高甘露糖型HBV颗粒,从HepG2.2.15细胞提取获得野生型HBV,并以荧光定量PCR法检测HBV DNA滴度；4.体外培养PBMC并诱导分化的DC分为DC-SIGN沉默与非沉默两组,每组三个亚组：对照组、加野生型HBV组,加高甘露糖型HBV组。在DC培养第5天将收获HBV颗粒(调整浓度为5×106copies/ml),加入到相应组的培养基中,培养至第7天时,进行如下检测；5.流式细胞术检测上述6个亚组中DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a、 HLA-DR的表达6. ELISA法检测上述6个亚组中DC细胞分泌细胞因子IL-10与IL-12p70的水平；7.MTT法检测上述6个亚组中DC细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;8. Westernblot法检测上述6个亚组中DC细胞NF-κB p65与p38的表达；三、HBe基因片段中促进Golgi M I活性的核心序列质粒的构建与鉴定1.取出本实验室保存的采用分子克隆的方法构建并鉴定过的HBe功能蛋白的真核表达载体(质粒),分析表达的HBe蛋白结构域；2. Wingene软件分析酶切位点,将HBe质粒的基因序列切分为三段目的序列,分别在每段序列的上下游加入酶切位点Xho I, BamH I。设计各序列引物,PCR扩增,将目的片段连接载体pEGFP-N1,构建分别包含三个表达HBe亚片段的真核表达载体,依次命名为HBe-1、HBe-2、HBe-3,分别进行测序鉴定;3.将上述3种含HBe亚片段的质粒和含HBe全长的质粒分别经Lipofectamine2000转染进入HepG2细胞内,设置空白对照组,用荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白的表达；4.RTPCR方法检测转染上述各质粒后5组HepG2细胞Golgi M I的2种亚型基因MAN1A1、MAN1A2的mRNA表达水平；5.Western blot检测转染上述各质粒后5组HepG2细胞MAN1A1、MAN1A2的蛋白表达水平；结果：一、树突状细胞DC-SIGN的基因沉默及其对树突状细胞免疫功能的影响1.成功选择了能使DC表面DC-SIGN基因沉默的siRNA序列。2.用siRNA沉默DC-SIGN,对以下指标无影响：DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86、 HLADR的表达水平、DC细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖能力、DC细胞IL-10及IL-12p70的分泌水平,以及DC细胞内NF-κB p65与p38的表达水平。二、野生型与高甘露糖型HBV对DC-SIGN基因非沉默与沉默的树突状细胞免疫功能的影响1. DC-SIGN非基因沉默的亚组中,与高甘露糖型HBV干预的DC亚组相比,野生型HBV干预的DC亚组,细胞表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表达较低,细胞培养上清中IL-12p70的水平较低而IL-10的表达水平较高,细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力较弱,细胞内NF-κB p65与p38的表达水平较低;2.在DC-SIGN基因沉默的三个亚组中,野生型HBV干预的DCs与高甘露糖型HBV干预DCs,上述指标无明显差异；3.不论是否进行DC-SIGN基因沉默,不论用野生型HBV或高甘露糖型HBV干预,与未用HBV干预的DC细胞相比,以HBV干预的DC,上述各指标表达均升高,具有明显统计学差异；三、HBe基因片段中促进Golgi M I活性的核心序列质粒的构建与鉴定1.成功构建三种分别含有三段HBe亚片段多肽基因的真核表达载体,且成功地将此三种质粒及含有HBe全长蛋白基因的质粒转染入HepG2细胞；2.转染了表达HBe全长或片段多肽质粒的HepG2细胞,不论转染的是哪一种质粒,与对照组相比,HepG2细胞MAN1A1mRNA的表达量上升；且除HBe-1组外,HepG2细胞MAN1A2mRNA的表达量也上升。3.转染了表达HBe全长或片段多肽质粒的HepG2细胞,不论转染的是哪一种质粒,与对照组相比,MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的表达量均上升；4. HBe-2转染入HepG2细胞后,其表达MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平平均值,均最接近转染HBe全长质粒组HepG2细胞的水平；其中特别地,HBe-2转染入HepG2细胞后,其表达MAN1A2蛋白的能力与HBe全长质粒组无差异。5.HBe-κ HBe-3质粒转染HepG2细胞后,其表达MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平,明显低于HBe全长质粒组的HepG2细胞。结论：1.siRNA对DC表面DC-SIGN进行基因沉默后,对DC细胞的免疫功能未观察到明显影响；2. DC-SIGN识别HBV后可以促进DC的成熟和免疫活化,相比高甘露糖型HBV,野生型HBV能一定程度地逃逸DC-SIGN的识别,这种逃逸机制与Golgi M I参与的去甘露聚糖修饰有关,并有可能导致DC的功能缺陷和HBV感染的慢性化,3.所要寻找的促进Golgi M I活性的HBV基因片段的核心序列最有可能位于HBe-2质粒片段中；但此核心序列发挥作用很可能需要其他片段的协同作用。