【摘 要】
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甘油作为渗透性冷冻保护剂对改善活力、活率、膜完整性等方面效果较好,被广泛应用于各种动物精子的冷冻保存,但随着分子生物学技术的进展,研究发现甘油浓度过高会对精子产生毒性作用。因此,本试验的主要目的是探究用Crocin或CLC替代部分甘油对冻融延边黄牛精子活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位、细胞凋亡、鱼精蛋白缺乏及膜脂质过氧化的影响。本试验选用延边黄牛精液,试验分为两部分,实验一(添加Croc
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甘油作为渗透性冷冻保护剂对改善活力、活率、膜完整性等方面效果较好,被广泛应用于各种动物精子的冷冻保存,但随着分子生物学技术的进展,研究发现甘油浓度过高会对精子产生毒性作用。因此,本试验的主要目的是探究用Crocin或CLC替代部分甘油对冻融延边黄牛精子活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位、细胞凋亡、鱼精蛋白缺乏及膜脂质过氧化的影响。本试验选用延边黄牛精液,试验分为两部分,实验一(添加Crocin替代部分甘油):分为鲜精组、对照组 6%甘油(未添加 Crocin)和 3%甘油+Crocin(0、0.5 mM、1 mM、2 mM)处理组;实验二(添加CLC替代部分甘油):分为鲜精组、对照组6%甘油(未添加 CLC)和 3%甘油+CLC(0、0.75 mg/mL、1.5 mg/mL、3 mg/mL)处理组。通过微生物动(静)态图像检测系统(CASA)检测精子活力,Hoechst33342/JC-1检测精子活率与线粒体膜电位,色霉素A3(CMA3)染色法检测鱼精蛋白缺乏水平和DNA损伤,流式细胞仪检测膜脂质紊乱,荧光定量PT-qPCR检测细胞凋亡、鱼精蛋白、氧化应激和精子顶体膜相关基因mRNA表达量,每组试验重复9次。试验结果表明:1.与对照组相比,3%甘油处理组精子活力、质膜完整性和顶体完整性均显著下降(P<0.05),3%甘油+1.5mg/mL CLC和3%甘油+1mM Crocin处理组的精子活力和质膜完整性显著提高(P<0.05),但顶体完整性无显著差异(P>05)。各冻融处理组与鲜精相比,精子活力、质膜和顶体完整性均显著下降(P<0.05);2.与对照组相比,3%甘油处理组精子活率和线粒体膜电位极显著下降(P<0.01),3%甘油+1.5mg/mL CLC和3%甘油+1mM Crocin处理组的精子活率和线粒体膜电位极显著提高(P<0.01)。各冻融处理组与鲜精相比,精子活率和线粒体膜电位均极显著下降(P<0.01)。3%甘油+1mM Crocin处理组与3%甘油+1.5mg/mL CLC处理组相比,3%甘油+1mM Crocin处理组线粒体膜电位更高;3.与对照组相比,3%甘油处理组精子膜脂质紊乱显著升高(P<0.05),3%甘油+1.5mg/mL CLC和3%甘油+1mM Crocin处理组的精子膜脂质紊乱显著下降(P<0.05)。各冻融处理组与鲜精相比,精子膜脂质紊乱均显著升高(P<0.05)。3%甘油+1mM Crocin处理组与3%甘油+1.5mg/mL CLC处理组相比,3%甘油+1mM Crocin处理组膜脂质紊乱更低(P<0.05);4.与对照组相比,3%甘油处理组精子鱼精蛋白缺乏水平显著升高(P<0.05),3%甘油+1.5mg/mL CLC和3%甘油+1mM Crocin处理组的精子鱼精蛋白缺乏水平极显著下降(P<0.01)。各冻融处理组与鲜精相比,精子鱼精蛋白缺乏水平均极显著升高(P<0.01)。3%甘油+1mM Crocin处理组与3%甘油+1.5mg/mLCLC处理组相比,3%甘油+1mM Crocin处理组鱼精蛋白缺乏水平更低;5.与对照组相比,3%甘油处理组鱼精蛋白基因(PRM2,PRM3)、顶体完整性相关基因(SPACA3)与促凋亡基因(BCL2)的表达量显著下降(P<0.05),氧化应激基因(ROMO1)的表达量显著升高(P<0.05),3%甘油+1.5mg/mLCLC和3%甘油+1mM Crocin处理组的鱼精蛋白基因(PRM2,PRM3)、顶体完整性相关基因(SPACA3)与抗凋亡基因(BCL2)的表达量显著升高(P<0.05),氧化应激基因(ROMO1)和促凋亡基因(BAX)的表达量显著下降(P<0.05),BCL2/BAX的表达量显著升高(P<0.05)。3%甘油+1mM Crocin处理组与3%甘油+1.5mg/mL CLC处理组相比,3%甘油+1mM Crocin处理组鱼精蛋白基因(PRM2,PRM3)、顶体完整性相关基因(SPACA3)和促凋亡基因(BAX)的表达量更高(P<0.05),氧化应激基因(ROMO1)和抗凋亡基因(BCL2)的表达量更低(P<0.05)。本研究得出的结论是:1.添加1mM的Crocin替代部分甘油后可以显著改善精子的活力、质膜完整性、活率、线粒体膜电位、膜脂质紊乱、鱼精蛋白缺乏水平和抑制细胞凋亡;2.添加1.5mg/mL的CLC替代部分甘油后可以显著改善精子的活力、质膜完整性、活率、线粒体膜电位、鱼精蛋白缺乏水平和抑制细胞凋亡。
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