论文部分内容阅读
植物转化酶按其在细胞中的分布可分为胞壁转化酶、胞质转化酶和液泡转化酶,可催化蔗糖不可逆分解为葡萄糖和果糖。近来研究发现,转化酶通过调节细胞渗透压、产生糖浓度梯度、参与信号物质传递等改变植物细胞生理状况、糖分的产生、运输、分配,以及改变特定基因的表达来调节植物的生长发育。本文克隆了番茄叶片酸性转化酶cDNA片段,构建成转化酶反义表达载体,转化番茄MicroTom,以获得转化酶基因反义抑制植株,并研究其在植物低温胁迫逆境反应中的作用,取得了以下主要结果:1以番茄（中蔬4号）叶片总RNA经过反转录PCR,克隆获得一个大小约为668 bp的cDNA片段,该片段与番茄液泡转化酶基因TIV1（GenBank登录号为Z12027.1）的mRNA序列符合率达99.71%。通体定向连接到植物表达载体pBinAR,构建成番茄液泡转化酶基因TIV1的反义植物表达载体pBinAR-aTIV1。2以番茄（中蔬4号）叶片总RNA经过反转录PCR,克隆获得一个大小约为416 bp的cDNA片段,该片段与番茄胞壁转化酶基因LIN6（GenBank登录号为AF506005）的mRNA序列符合率达99.3%。通体定向连接到植物表达载体pBinAR,构建成番茄胞壁转化酶基因LIN6的反义植物表达载体pBinAR-aLIN6。3建立了番茄MicroTom的高效再生体系。具体操作为:番茄MicroTom种子由3%NaClO表面消毒15 min,在MS固体培养基上发芽,获得无菌苗,无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,接种在B5 +IBA0.05mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1的培养基上,子叶和下胚轴外植体的不定芽再生率最高,分别为95.8%和60.0%。4建立了番茄MicroTom的农杆菌EHA105介导的高效转化体系。转化参数为:外植体黑暗预培养2d,以B5液体培养基（含乙酰丁香酮200μmol/L）稀释的新鲜农杆菌EHA105/pBinAR-aLIN6侵染外植体,侵染菌液浓度OD600=0.5,侵染时间10min,共培养时间为2d。诱导培养基中筛选压Kan浓度为50mg·L-1;抑菌抗生素为300mg·L-1的头孢哌酮钠舒巴坦钠。5获得了110株Kan抗性芽,PCR检测、Southern斑点杂交、酶活性测定确定5株为阳性转化株T42、T43、T61、T67、T92,其叶片胞壁转化酶活性比对照分别下降67.9% , 13.4%,73.5%,85.6%,58.0%。对转化株T61的半定量RT-PCR检测表明,其基因转录水平下调了65.6%。6以非转基因再生苗为对照,低温胁迫处理LIN6基因反义转化植株（15℃光照14h,10℃黑暗10h,光照强度4000lx）,番茄叶片光合速率、类胡萝卜素、非还原性可溶糖、可溶性糖含量、胞质转化酶和液泡转化酶活性均出现下降。对其各测定指标间的相关分析结果表明,低温下胞壁转化酶活性同番茄叶片类胡萝卜素含量、胞质转化酶和液泡转化酶活性以及叶片光合速率下降存在显著或极显著的相关关系;胞壁转化酶的作用机理是胞壁转化酶在番茄低温胁迫下的逆境反应中的作用主要是维持叶片细胞一定的可溶性糖水平,主要是非还原性可溶糖水平。该研究结果初步揭示了胞壁转化酶在低温胁迫下番茄叶片逆境反应中的作用,对生产中喷施糖液、植物激素类物质及保护类胡萝卜素等的栽培措施提供了直接的理论依据,并为植物耐低温育种选择指标提供了一定的参考。