【摘 要】
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目的:通过免疫共沉淀和质谱分析筛选与肌球蛋白VI相互作用的蛋白,并探索αⅡ血影蛋白参与耳蜗毛细胞静纤毛结构稳定的机制。方法:提取SD大鼠耳蜗蛋白,免疫共沉淀联合质谱分析
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目的:通过免疫共沉淀和质谱分析筛选与肌球蛋白VI相互作用的蛋白,并探索αⅡ血影蛋白参与耳蜗毛细胞静纤毛结构稳定的机制。方法:提取SD大鼠耳蜗蛋白,免疫共沉淀联合质谱分析筛选与肌球蛋白VI相互作用的蛋白。选取αⅡ血影蛋白,通过免疫荧光和Western blot分析正常C57BL/6J小鼠αⅡ血影蛋白在耳蜗毛细胞的时-空分布;利用CRISPR/Cas9技术构建αⅡ血影蛋白敲除小鼠,并以雄性和雌性纯合子(Gfi1-cre-/+;Sptan1f/f)及其同窝对照(Gfi1-cre-/+;Sptan1f/+)作为实验组和对照组。两组小鼠在1月时行听性脑干反应、复合动作电位等听功能评估,再通过免疫荧光、扫描电镜、透射电镜等技术,观察静纤毛和毛细胞胞体变化;通过琥珀酸脱氢酶染色进行毛细胞计数,探索毛细胞缺失情况;通过Caspase-3染色,探索毛细胞凋亡情况;通过免疫荧光等技术观察βⅡ血影蛋白表达情况,探索αⅡ与βⅡ血影蛋白相互作用情况;通过FM1-43探索毛细胞功能情况。结果:通过免疫共沉淀和质谱分析发现了20余种与肌球蛋白VI相互作用的蛋白,其中αⅡ血影蛋白在表皮板与肌球蛋白VI共表达。之后研究发现正常C57BL/6J小鼠的αⅡ血影蛋白表达量在出生后1天和3天时明显高于7天和30天。基因敲除小鼠在1月龄时表现为早发性听力下降,外毛细胞静纤毛形态异常随着出生时间的延长而逐渐加重,出生后15天时部分外毛细胞表现为静纤毛根部不发育且出现约40%缺失,1月时出现约80%缺失。部分外毛细胞出现凋亡,残存的毛细胞功能尚存在。此外,基因敲除小鼠缺失αⅡ血影蛋白的毛细胞也缺失βⅡ血影蛋白。结论:共发现20余种与肌球蛋白Ⅵ相互作用的蛋白质,其中αⅡ血影蛋白对耳蜗毛细胞静纤毛形态及毛细胞的存活至关重要,缺乏会导致听力下降及静纤毛形态异常等。
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