促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)又称为促皮质素(Corticotropin),由39个氨基酸构成的多肽类激素,主要由垂体前叶分泌而成。此外,也发现于下丘脑、肾上腺髓质等组织中。ACTH参与调控糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)的合成与分泌,影响糖、脂肪和蛋白质的合成与代谢,调节心脑血管功能,提高机体抵抗力,促进神经损伤恢复与再生,还具有抗炎、免疫抑制、抗毒素、抗休克等作用。ACTH是治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药,ACTH的半衰期很短,约为10 min,需要反复大量用药。目前,国内临床应用的ACTH由家猪的脑垂体中提取,容易传播动物病毒和支原体。人工合成的ACTH(1-24)的体内半衰期更短,并且工业化合成成本较高。本研究希望获得相较于野生型(WT)ACTH具有较强药理学作用、较长体内半衰期的ACTH前体。1.目的1.1四种ACTH前体蛋白(ProACTHs)在工程菌中的表达和纯化;1.2体内药理学实验,分析和比较4种ProACTHs以及WTACTH的药效;1.3体内药代动力学实验,分析和比较药效最强的ProACTH141以及WTACTH的半衰期(T1/2)、代谢物达峰时间(Tmax),药时曲线下面积(AUC)。2.方法2.1融合蛋白的表达和纯化针对能被PC特异识别的POMC中的酶切底物序列(POMCst)设计包含ACTH的 4 种 ProACTHs。优化和合成 HisTag-EKst-ProACTHs 的 cDNA 序列,其中 EKst编码可被肠激酶(EK)识别切割的短肽氨基酸序列“DDDDK”。构建表达ProACTHs的HisTag-EKst-ProACTHs pET21a质粒,将其转入大肠杆菌感受态BL21-DE3菌株中,IPTG诱导表达蛋白。利用Ni柱纯化出4种HisTag-EKst-ProACTHs,然后用带His标签的EK切除连接在ProACTHs的N末端的多余片段,再用Ni柱去除EK和HisTag-EKst。2.2药理学研究体内实验,小鼠尾静脉注射4种ProACTHs和WTACTH,在0、6、12、24、36及48 h快速摘眼球采血,并采用RP-HPLC法分析比较小鼠血清中GC浓度变化。在此基础上筛选出作用最强的ProACTH。2.3药代动力学研究小鼠尾静脉注射药效较强的ProACTH和WTACTH,在1、5、10、15、20、30、45、60、80及100 min快速摘眼球采血,并采用RP-HPLC法分析ProACTH及其代谢产物ACTH39以及WTACTH在小鼠血清中的浓度变化。3.结果3.1四种HisTag-EKst-ProACTHs蛋白表达水平较高,纯化后4种ProACTHs的纯度均较高。3.2药理学实验结果表明:对体内GC水平的影响实验中,ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80 和 ProACTH141 的 AUC 分别为 12,002、11,044、11,931和 14,571 ng/mL·h,均高于 WTACTH(5,659 ng/mL·h)。3.3药代动力学实验分析结果表明:ProACTH141的半衰期(T1/2)为21.9 min;其代谢物ACTH39在血清中的达峰时间(Tmax)为20 min,野生型ACTH的半衰期(T1/2)为 11.7 min。ProACTH141 及其代谢产生的 ACTH39 的AUC 分别为 28,841和 19,812 pmol/mL·min。4.结论ProACTH141体内刺激GC产生的药理学作用更强,与WTACTH相比,能更好的提高药代动力学特点。