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目的:硕士期间的研究工作表明,大鼠纹状体内给予线粒体毒素3-硝基丙酸(3-NP)引起的纹状体神经元死亡伴有自噬和凋亡激活,p53诱导的DRAM1表达在自噬激活和细胞死亡中有重要作用。本论文研究DRAM1调节细胞线粒体失能引起的自噬激活和细胞死亡的分子机制。方法:(1)建立3-NP所致A549细胞线粒体失能毒性模型。3-NP处理细胞24, 48和72h后,Western blot法测定DRAM1,BAX,p62和LC3等凋亡和自噬蛋白的表达和线粒体细胞色素C的释放,免疫荧光法检测LC3的表达,观察自噬和凋亡通路的激活。(2)观察自噬和凋亡过程在3-NP所致的细胞线粒体毒性引起的细胞死亡中的作用。Western blot法检测Atg5的siRNA干扰效果。WST-1法检测Atg5 siRNA干扰和Z-VAD-FMK对3-NP诱导的细胞死亡的影响。(3)检测DRAM1在3-NP诱导的细胞自噬流量变化中的作用。Western Blot法检测DRAM1的siRNA后观察p62,LC3等自噬蛋白的表达。免疫组化法检测DRAM1蛋白下调后3-NP所致的LC3表达的变化。(4)研究DRAM1调节3-NP诱导的细胞自噬流量的作用机制。免疫荧光双标法观察DRAM1和溶酶体标志物LysoTracker在细胞内的共定位情况。为了观察DRAM1在细胞清除自噬-溶酶体中的作用,野生型细胞和DRAM1 siRNA干扰细胞分别用雷帕霉素处理24h以及处理6h后撤去雷帕霉素,采用Western blot法检测LC3的蓄积情况,并对LC3点状聚集进行量化,以及用免疫组化法观察LC3和Lamp2检测在胞质内的降解情况。为了观察DRAM1影响自噬体的降解机制,用Western blot法检测Cathepsin D的激活以及使用分子探针观察氢质子泵和溶酶体的酸化情况。(5)验证DRAM1是否是通过溶酶体来调节自噬流量。使用溶酶体抑制剂E64d和氯喹抑制溶酶体后观察是否会产生LC3的蓄积,采用Western blot法观察了抑制溶酶体后Cathepsin D的变化,以及用WST-1法观察是否影响细胞活力。(6)检测DRAM1在3-NP诱导的细胞凋亡过程中的作用。Western Blot法观察DRAM1表达降低后BAX的表达和线粒体细胞色素C的释放以及caspase-3的激活。(7)检测DRAM1调节3-NP所致细胞凋亡的机制。Western Blot法验证BAX siRNA干扰和过表达的效率。为了研究BAX在DRAM1调节凋亡中的作用机制,采用Western Blot法观察BAX的表达降低后对于Cathepsin D和casepase 3的激活以及细胞色素C的释放的影响。WST-1法检测BAX表达降低后对3-NP引起的细胞死亡的影响。结果: (1)在不同时间点3-NP所致A549细胞线粒体失能毒性模型中,Western blot和免疫荧光结果显示DRAM1,LC3自噬相关蛋白在24-48h达到高峰(p<0.01),自噬底物蛋白p62蓄积减少(p<0.01)。同时,凋亡相关蛋白BAX和细胞色素C的释放在48-72h达到高峰(p<0.01)。表明3-NP导致了自噬和凋亡过程的激活。(2) Western blot结果显示Atg5 siRNA干扰后,Atg5蛋白表达明显降低(p<0.01)。WST-1法结果显示Atg5表达降低和Z-VAD-FMK处理对3-NP所致细胞死亡有显著抑制作用。表明自噬和凋亡过程都参与了3-NP诱导的细胞死亡。(3) Western blot结果显示DRAM1的siRNA干扰效果明显(p<0.01),并且DRAM1蛋白表达降低后对3-NP所致自噬相关蛋白LC3的升高有明显抑制作用(p<0.01),自噬底物蛋白p62表达升高(p<0.01)。说明siRNA干扰DRAM1后细胞自噬流量降低。(4)免疫荧光双标结果显示DRAM1和溶酶体标志物LysoTracker在胞质内的共定位现象明显。雷帕霉素处理24h组和处理6h后撤去雷帕霉素组的结果显示,siRNA干扰DRAM1细胞组在撤去雷帕霉素后LC3和Lamp2的清除情况明显比野生型细胞要缓慢。LC3的量化结果表明了siRNA干扰DRAM1组LC3-II在撤除雷帕霉素后下降减慢。Western blot结果显示siRNA干扰DRAM1对3-NP所致Cathepsin D的激活有明显抑制作用(p<0.01)。说明siRNA干扰DRAM1细胞对比野生型细胞对胞内自噬溶酶体的清除能力降低。溶酶体酸化指示剂和量化结果显示siRNA干扰DRAM1对3-NP所致的溶酶体酸化程度降低(p<0.01)。氢质子泵结果显示siRNA干扰DRAM1对3-NP所致的氢质子泵的激活有抑制作用。说明siRNA干扰DRAM1的细胞溶酶体酸化作用降低,清除自噬溶酶体能力减弱。(5)免疫荧光双染结果显示,当线粒体毒性药物3-NP处理后,LC3和Lamp2表达明显增加,并且共定位现象明显。E64d和氯喹处理后,LC3和Lamp2蓄积明显增加。Western blot结果表明3-NP诱导的LC3Ⅱ在E64d处理后显著上升(p<0.05), 3-NP诱导的LC3Ⅱ在氯喹处理后也有显著上升(p<0.01)。Western blot结果表明在E64d和氯喹处理后3-NP诱导的细胞色素C从线粒体内的释放显著减少(p<0.01)。WST-1结果显示WT细胞在溶酶体抑制剂处理后,细胞活力没有很明显的变化(p>0.05),但溶酶体抑制剂显著抑制了3-NP导致的细胞死亡(p<0.05)。说明抑制了溶酶体就抑制了自噬的流量和3-NP诱导的细胞死亡,而DRAM1就是通过溶酶体来达到调节自噬流量的作用。(6) Western blot法结果显示DRAM1蛋白siRNA干扰后对3-NP所致BAX蛋白升高有明显抑制作用(p<0.01),线粒体细胞色素C的释放减少(p<0.01), caspase-3的激活减少(p<0.01)。(7) Western blot结果显示BAX siRNA干扰后,BAX蛋白表达明显下降(p<0.01)。Western blot结果显示,细胞内BAX表达降低会抑制3-NP诱导的Cathepsin D和casepase-3的激活(p<0.01)和3-NP诱导的细胞色素C的释放(p<0.01)。WST-1结果显示BAX的siRNA对3-NP所致的细胞死亡有明显抑制作用(p<0.01)。说明DRAM1有可能通过BAX来调节3-NP诱导的凋亡过程。结论:本文研究结果表明DRAM1通过促进溶酶体酸化和激活溶酶体酶来调节自噬流量,同时DRAM1通过上调BAX来调节线粒体介导的凋亡通路。正在进行中的工作:自噬体和溶酶体的融合对于自噬体的降解是一个很重要的过程,因此对于深刻的了解DRAM1在自噬体和溶酶体融合中的作用正在研究中。DRAM1通过BAX来调节线粒体信号凋亡通路是一个重要的发现,DRAM1如何调节BAX的表达正在进一步研究中。