双氢青蒿素治疗酒精性脂肪肝的作用及机理研究

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[背景]氧化应激和脂质异常堆积是酒精性脂肪肝(Alcoholic liver disease,ALD)的重要发病机制。当前研究表明肝细胞中的脂肪堆积会产生脂毒性。脂毒性会引起JNK的激活和内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激的产生,进而诱导线粒体功能紊乱,激活线粒体凋亡通路,导致细胞凋亡。研究发现酒精会导致肝脏中氧化还原稳态失衡。而氧化应激和脂质异常堆积也是导致未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)和ER应激的主要原因。因此靶向肝细胞脂凋亡可能成为治疗ALD的新策略。大量研究显示lipin-1在ALD导致的脂肪变性的调控中具有关键作用,和酒精导致的肝损伤也有密切联系。本课题组前期研究结果表明,天然产物青蒿素衍生物双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)对酒精性脂肪肝表现出显著疗效。DHA能有效缓解ALD大鼠的脂肪变性和肝损伤。本研究旨在明确DHA对酒精诱导的肝细胞脂凋亡的影响,并阐明其作用的分子机制。为DHA的作用机理研究提供了全新的思路和明确的方向。[方法]本论文主要围绕体内、体外两部分实验进行展开。1、体外研究选取永生化人肝细胞LO2细胞株作为本论文体外研究对象。以油红O染色实验及尼罗红染色实验观察肝细胞脂肪堆积情况,以总胆固醇(Total Cholesterol,TC),甘油三酯(Triglyceride,TG)试剂盒检测细胞中脂肪合成情况,以CCK-8试剂盒和TUNEL染色、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的膜连蛋白V/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染检测肝细胞的生长与凋亡。以JC-1染色检测肝细胞线粒体稳态情况,Western blot法免疫荧光染色法用于检测肝细胞内目的蛋白的表达与活化。2、体内研究将42只雄性ICR小鼠随机分成6组(每组7只):正常对照组、酒精模型组、DHA治疗组、雷帕霉素(Rapamycin)治疗组,lipin-1β过表达组,lipin-1β过表达及DHA联合给药组。以苏木精-伊红染色法观察大鼠微观结构,以免疫组织化学染色法观察小鼠肝脏中促炎性因子的表达情况。以试剂盒检测小鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT),谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量,TC,TG,以酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清中白介素6,白介素8,肿瘤坏死因子α,C/EBP 同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)的含量 Western blot法免疫荧光染色法用于检测小鼠肝组织内目的蛋白的表达与活化。[结果]体外研究结果显示,DHA能够剂量依赖性的抑制酒精诱导的肝细胞脂肪变性,并下调促脂肪合成基因,上调脂肪氧化相关基因表达。同时TUNEL染色结果显示,DHA能够抑制酒精导致的肝细胞凋亡,这按时DHA对脂凋亡有一定调控作用。Western blot结果显示DHA能够剂量依赖性的抑制脂凋亡相关的内质网应激-JNK/CHOP-线粒体凋亡相关信号通路,JC-1染色也显示DHA对脂毒性引起的线粒体紊乱有一定缓解作用。机制研究发现DHA缓解酒精诱导的肝细胞脂凋亡作用可能和mTOR的活化抑制有关,并且DHA能够剂量依赖性的抑制lipin-1的表达并调节lipin-1的核转位。DHA通过减轻脂凋亡改善酒精导致的肝细胞损伤,可能和mTOR对lipin-1的调节作用有关。体内研究显示,相较于正常对照,酒精模型组小鼠肝脏肝细胞中lipin-1荧光强度明显增加,并在胞质中表达增多,和Western blot分析结果一致,Rapamycin和DHA可明显下调小鼠lipin-iβ的表达,增加lipin-1α表达。血清学检测和免疫组化实验结果表明,DHA能够显著改善酒精导致的小鼠肝损伤,炎症浸润,这一系列作用能够被lipin-1β过表达削弱,并和Rapamycin表现出协同作用。油红O染色,试剂盒检测TC,TC含量实验结果显示,lipin-1β过表达削弱了 DHA对肝脏脂肪变性的改善作用,同时Rapamycin改善肝脏脂肪代谢紊乱作用与DHA类似。Western blot检测脂肪合成与脂肪酸分解相关基因也得到了一致的结果。机制研究发现,lipin-1β能削弱DHA对脂毒性导致的肝细胞线粒体和内质网功能紊乱的改善作用,因此DHA减轻脂毒性导致的肝细胞凋亡作用与抑制mTOR活化进而调节lipin-1有关。[结论]体外部分结果表明,DHA能够改善酒精导致的肝细胞脂肪变性,并可通过减轻脂毒性导致的细胞凋亡相关通路改善酒精诱导的肝细胞损伤,并且这一作用与DHA对mTOR活化的抑制作用有关。体内研究部分表明,DHA和Rapamycin作用一致能够抑制lipin-1β的表达,促进lipin-1的入核。DHA通过抑制mTOR活化,调节lipin-1的表达与核转位改善了 ALD导致的肝损伤和炎症浸润,并通过缓解ALD的脂肪变性减少脂毒性导致的肝细胞凋亡。
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