研究背景： 基因治疗作为一种新的治疗方法，被认为是医学科学中最新、最有潜力和最可能发生革命性变化的领域。目前，基因治疗亟待解决的问题是在如何在活体实时、无创伤地检测目的基因的表达、分布和治疗的疗效。分子影像学通过反映机体内细胞和分子水平的改变，能够在活体上对基因治疗效果进行评价，而不影响其生理活动，具有远大的前景。目前基因表达显像应用的主要技术手段包括：核医学、MRI、光学成像。由于MRI空间分辨率高(已达μm级)，设备比较普及，同时可获得解剖及生理信息，MRI分子影像学成为近年来的研究热点。MRI分子影像学以报告基因为基础，报告基因即基因的表达产物能与携带影像学标记物的分子探针特异性结合，从而可为影像学设备所检测到的基因。其中一个热点研究的报告基因是酪氨酸酶基因，酪氨酸酶是催化合成黑色素的关键酶。黑色素是一种阴离子，能与铁等金属高效结合，降低了金属回旋的相关性时间，使MR的T1弛豫时间变短，表现为特征性的T1加权像高信号。 基因治疗的关键技术是转染，转染需要合适的载体。目前研究用的是非病毒载体，虽然非病毒载体具有简便、安全、容量高的优点，但转染效率低且缺乏细胞特异性，应用受到限制。为了进一步研究酪氨酸酶—黑色素报告基因系统，我们需要寻找一种高效的载体。由于腺病毒具有许多优点，如使用安全，制备容易，能获得高纯度、高滴度的腺病毒载体；以游离型存在，不整合进入宿主DNA中，无遗传毒性；表达时间短暂，一般15-20天，适合—过性表达的需要；载导容量相对较大，理论上可携带37kb的DNA；感染宿主范围较广，处于静止期的细胞也能感染。本研究以酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞，观察腺病毒载体运送酪氨酸酶基因转染体外细胞的效果。 研究目的： 观察酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞的效果及黑色素的表达情况。 1、构建酪氨酸酶基因腺病毒重组体。 2、利用酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞。 3、检测转染细胞DNA内报告基因导入情况及转染细胞内黑色素表达情况。 4、利用磁共振成像(MRI)对转染细胞进行扫描，观察转染细胞的信号特征。 材料和方法： 一、酪氨酸酶基因转染 1、构建酪氨酸酶基因腺病毒重组体，委托东方肝胆外科医院病毒基因治疗室代为合成，pcDNA3tyr质粒由美国哈佛分子影像中心Simonova博士惠赠。 2、HepG2细胞的培养 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，每2-3天换液一次。采用100mm直径的一次性培养皿，待细胞汇合50％约106个细胞且处于对数生长期时使用。 3、转染 细胞生长达到106个时以无血清高糖DMEM培养液换液，在1～4号培养皿中分别加入空白腺病毒载体及MOI为50、150、300的ad—tyr，作为对照组及实验组。转染6小时后吸去含病毒培养液，PBS轻柔冲洗(2×4 ml)后换以含10％胎牛血清培养液，培养72小时后以胰酶消化，行后续检测。5号培养皿加入绿色荧光蛋白基因重组腺病毒。 二、MRI成像 胰酶消化后获取细胞悬液(经计数为106个细胞)，1200rpm离心5分钟使之沉淀于EP管底，仔细吸除上清后将1～4号离心管平行放置，分别代表空白对照及MOI为50、150、300转染病毒的细胞团。行T1WI(TR/TE500/15ms)、T2WI(TR/TE2600/100ms)、STIR(TR/TE432/60ms)序列检查，扫描线圈采用C3线圈，内径11cm，矩阵400×432，Fov15cm×15cm，层厚1.5mm，层距—0.7mm。 三、转染细胞的验证 结果： 1.MRI检查结果 对转染细胞团进行T1WI、T2WI、STIR检查，转染细胞团均出现高信号，空白对照细胞团未见高信号或仅出现微弱高信号，并呈现一种趋势，转染病毒量越大，信号越高。至MOI150以后，其信号增高不再明显。 2.黑色素染色 转染细胞染色较深，呈深褐色，胞浆内可见大量黑褐色颗粒。空白对照细胞内缺乏上述深褐色染色。 3.Real—Time PCR 1～4号样品中酪氨酸酶基因(Tyr)的表达量差异倍数分别为1、62.55、617.34、612.25。实验组的酪氨酸酶基因(Tyr)的表达量相对空白对照组显著提高。 4.绿色荧光成像在荧光显微镜检测中，绝大部分经绿色荧光蛋白基因腺病毒重组体转染的HepG2细胞内都可见绿色荧光。 结论： 1、腺病毒作为运送载体可以高效地运送酪氨酸酶基因进入HepG2细胞并成功表达。 2、酪氨酸酶基因作为报告基因，利用其合成的黑色素来反映体外细胞基因转染情况的技术方法是可行的。 3、MRI能够检测到HepG2细胞内由外源基因表达合成的黑色素，说明分子影像学技术可以初步评价体外细胞基因转染的效果，影像学在基因治疗中可以发挥重要的作用。