生物活性材料支架诱导内源性神经发生修复成年大鼠脑损伤的研究

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脑海马损伤后,导致空间识别与学习记忆障碍,已有研究证明,哺乳动物的大脑在整个生命过程中均存在神经发生。各种损害会刺激成年大脑的神经前体细胞原位增殖,但内源性神经发生效率极低,不足以修复损伤或疾病所导致的缺陷。本研究将生物活性材料支架,即载有神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)-壳聚糖载体移植入损伤区-海马CA1区及其顶部皮层后,观察海马齿状回(dentategyrus,DG)的颗粒细胞下层(subgranularzone,SGZ)和侧脑室的室管膜下区(subventricularzone,SVZ)的内源性神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的激活、增殖,并迁移和分化的情况;损伤区内新生的神经元是否功能性地整合到原有的脑回路中。  本研究通过尼氏染色和免疫三标技术来观察损伤区内是否存在神经元;通过BrdU的腹腔注射与特定抗体(nestin、Dcx、β-tubulinⅢ、NeuN、MAP2和NF)结合的免疫三标技术来验证这些神经元是新生的;将1,19-二(十八烷基)-6,69-二(4-磺苯基)-3,3,39,39-四甲基吲哚碳氰(DiI)注射至侧脑室并结合特定的免疫三标技术来观察损伤区新生神经元的来源,迁移途径;借助免疫电镜和MED64平面微电极阵列技术观察损伤区新生神经元是否形成突触联系,以及是否能够功能性地并与宿主脑组织形成神经环路。  本研究结果提示:NT-3-壳聚糖载体可促进新的神经发生。NT-3-壳聚糖载体组SVZ和SGZ中的BrdU+/nestin+NSCs、BrdU+/Dcx+神经元数量明显多于单纯损伤组和单纯壳聚糖载体组(不载有NT-3)。NT-3-壳聚糖载体组损伤区内BrdU+/NeuN+及BrdU+/MAP2+的新生神经元数量明显高于上述两个对照组。以上结果提示NT-3-壳聚糖载体可以激活并提高内源性神经发生的效率,促进内源性神经干细胞增殖、迁移到损伤区并分化为成熟神经元。在将DiI注射至侧脑室3天-30天期间,我们观察到:NT-3-壳聚糖载体组中DiI标记的侧脑室周围的细胞迁移到损伤区的过程,并且部分DiI+细胞表达MAP2,提示:NT-3-壳聚糖载体可诱导SVZ细胞迁移到损伤区并分化成熟神经元,初步验证了损伤区新生神经元的来源部位。应用免疫电镜技术,观察到损伤区内出现成熟的突触结构。借助MED64系统,刺激NT-3-壳聚糖载体组大鼠脑损伤区新生组织或CA3锥体细胞的Schaffer侧支,在新生组织的多个位点能产生场电位,并可被河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)抑制并可洗脱;借助无钙液和6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitroqui-noxaline-2,3-dione,CNQX)可抑制神经轴突终末与钙相关的突触释放及场兴奋性突触后电位(fieldexcitatorypostsynapticpotential,fEPSP)并可经人工脑脊液洗脱。高频刺激Schaffer侧支,在损伤区新生组织中可诱发长时程增强(long-termpotentiation,LTP),并可被CNQX抑制并可洗脱。上述结果提示新生神经元之间及新生神元与宿主神经元之间能建立功能性的突触联系,导致神经环路得到重建。本研究证明NT-3-壳聚糖载体能够激活内源性神经发生修复脑损伤,这为今后深入探讨应用生物活性材料支架诱导内源性神经干细胞修复脑损伤的机理和临床应用奠定了基础。
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