在肝脏手术中,为了减少出血,经常需要进行肝血流的阻断,而各种血流阻断必然会造成肝脏的缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury, IRI)。缺血再灌注的损伤不但会造成大量的肝细胞直接损害,而且影响了肝细胞再生的能力,是影响肝脏手术成功率和患者术后生存率的重要因素之一。随着手术技术的不断发展,已有大量的肝癌、肝纤维化、脂肪肝等肝病患者进行了复杂的、较大范围的肝切除术甚至行肝移植术。尽管通过对肝脏解剖更进一步的熟悉掌握,特别是肝内胆道、血管解剖以及术中通过在麻醉过程中降低静脉压力,各种切、凝手术器械的发展使得非血流阻断下手术切肝成为现实。目前通过阻断血流减少术中出血,仍是肝脏手术的常用手段。较为常用的阻断方法有第一肝门阻断、全肝血流阻断、选择性入肝血流阻断等等。无论哪一种血流阻断的方式,都可以在一定程度上降低肝脏手术中出血的发生率。但缺血再灌注损伤仍然是必须面对且复杂的问题。除了肝脏血清酶学检测、病理组织切片、CT等手段,能否找到一种新的检测手段,更全面判断肝切除、肝移植术后患者的肝功能情况,甚至对其他相关器官的影响,从而为更好的、全面的进一步诊断及治疗提供线索。用压迫肝十二指肠韧带控制肝脏出血的Pringle法,因其操作简便、易行,且效果确切,是目前临床运用最为广泛的,用于控制切肝出血的措施,几乎可用于所有肝脏手术中。本研究采用Pringle法构建了肝脏缺血再灌注模型,对于缺血再灌注的研究,有较高的代表性。代谢组学发展于20世纪90年代,通过体外因素,对生物体内代谢物的变化进行定量分析,寻找代谢物类型和数量变化与生理及病理变化的相互关系和动态规律。代谢组学着重研究的是生物整体、器官或组织内源性代谢物质途径及其所受内在或外在因素的影响及随时间变化的规律。可通过对代谢样本的代谢产物分析,运用模式结合软件,分析有差异的代谢物,找出潜在的标记物(biomarker),为疾病的诊断提供依据。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后出现的一门新兴学科,且可以作为一门新的临床生化技术用到某些疾病的检测、诊断和治疗。尿素酶预处理-气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)是代谢组学研究中的重要方法,具有较高灵敏性,能够分析高度复杂的生物体液。不仅能使样品的分离、鉴定和定量一次性且迅速完成,还可以很大程度促进对批量物质的整体和动态分析。GC/MS能够一次性测定上百个分子量小于1000的分子,能够瞬间勾勒出肝脏中合成和利用小分子代谢的情况。与目前常规运用于临床的血清酶学的肝功能检测、病理、CT等手段相似,体现了某个阶段肝功能的大致情况,同时还可以反映出其他器官如肾脏、心脏等器官的信息,甚至可以用于对比用药前后药物从机体代谢的情况。目前暂未有关于代谢组学运用于肝脏术后缺血再灌注损伤评估的报道。肝脏是人体最大的代谢器官,被誉为“物质代谢中枢”,能够代谢糖、蛋白、脂肪、维生素、激素等。对于维持机体内环境平衡起到非常重要的作用。目前缺少一种方法,能够在整体层面上反映机体代谢情况,全面检测肝脏各个时间段代谢产物的动态分布以评估疾病治疗及预后。目前,利用代谢组学对于肝移植、肝硬化、乙型肝炎、脂肪肝等的研究已逐步展开。本实验的研究目的在于利用代谢组学的方法对比肝脏缺血再灌注损伤前后代谢产物的变化,了解肝脏术后代谢的损伤、转归的变化趋势,结合血清酶学、病理等常规方法,更完善地检测肝脏术前、术后情况,全面的检测肝脏的情况。代谢组学主要以尿液、血液、组织匀浆等为研究对象,标本较易获得,监测较为方便。目前代谢组学主要有核磁共振(NMR)和质谱(mass spectrometry)两种理论学说。研究较新的倾向于质谱,GC/MS色谱质谱联用技术比质谱更加完善,是目前运用最为广泛的分离分析技术且分析能力强,灵敏度较高。本研究采用代谢组学GC/MS的方法,对大鼠肝脏缺血再灌注损伤前后进行对比、分析,寻找早期检测、诊断的重要标志物,对于临床运用有一定的价值。材料和方法1.大鼠缺血再灌注模型的建立取SPF级纯系SD(Spargue-Dawley)雄性大鼠,质量均为220-250g。1.1分组将大鼠随机分成对照组(20)和实验组(60),实验组按照设计时间点(术后1、3、5天)随机分三组(n=20)。1.2模型制作1.2.1实验组SD大鼠采用乙醚吸入麻醉后,取腹部正中切口进入腹腔。充分显露第一肝门,予血管夹横贯肝动脉、门静脉、胆总管,夹闭30分钟,后松开、关腹。术后,按照实验设计的时间点,分别于术后1、3、5天收集尿液标本,并在尿液标本收集完成后再次开腹获取血液及肝脏标本。1.2.2对照组SD大鼠直接收集尿液标本,开腹获取血液及肝脏标本。2.标本收集2.1尿液标本的收集2.1.1各组大鼠在开腹前12小时置入代谢笼中收集尿液,约每只4ml。2.1.2所取尿液标本存储于-20℃冰箱,一周内进行标准化处理后,进行代谢组学GC/MS检测。2.2血清酶学检测2.2.1各组按规定的时间开腹,取门静脉血,约3ml每只。2.2.2血液标本静置10分钟后,离心,取血清标本冻存于-70℃冰箱,一并送检,测量血清AST、TBIL、ALP。2.3肝脏HE病理2.3.1完成静脉血标本收集后,完整取出肝脏组织,快速切取肝中叶标本,置入10%中性甲醛溶液固定。统一进行脱水,石蜡包埋、切片,按标准操作行HE染色,光镜下观察结果。3.统计学分析3.1血清酶学指标分析：应用统计软件SPSS13.0进行统计分析,P<0.05表示有统计学意义;由于数据多数不满足正态,采用开平方根转换使得数据基本达到正态；计量资料以x±s表示,多组比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Tukey法；丙酮酸和丙氨酸转换后仍不满足正态,多组比较采用非参秩和Kruskal-Wallis H检验,组间两两比较采用Mann-Whitney U检验。对P值进行Bonferroni校正。3.2代谢组学的主成分分析Principle component analysis (PCA):所有的代谢产物数据应用SAS统计软件。检验水准α设为0.05,当需要进行多重比较时,校验值设为0.01。结果1.血清酶学指标：ALT、TBIL在术后1天组明显升高,术后3天逐渐下降,至术后5天逐渐恢复至正常水平。2.病理HE结果：按Suzuki评分标准,术后1天：肝细胞损伤较为严重,有较多的细胞出现坏死,有明显的充血、淤血表现,可见少量空泡。术后3天：较术后1天有所好转,可见肝细胞形态逐步在恢复,肝血窦代偿性扩张,仍有极少量空泡;偶可见个别坏死细胞；有极少量充血表现。术后5天：未见有空泡形成；未见有坏死细胞；仍有极少的淤血、充血表现。基本已经恢复至正常水平。对照组(正常肝组织)：肝小叶结构清晰,肝窦呈条索状,排列紧密,肝细胞形态正常,核深染,胞质均匀。3.代谢组学结果：术后1天,乳酸、甘油3磷酸较正常组明显升高；术后3天至术后5天逐渐下降至正常水平。丙氨酸、丝氨酸在术后1天明显降低；术后3天至5天逐步升高至接近正常水平。丙酮酸、苏氨酸、油酸没有统计学差异。结论1.大鼠肝门阻断30分钟后,肝脏的缺血再灌注损伤术后第一天最为严重,血清酶学指标达高峰、病理损伤最为严重;术后第3天开始好转,至术后第5天已基本恢复至正常水平。血清酶学、肝脏的病理切片结果所反应的变化趋势基本一致。2.尿素酶预处理-气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)的代谢组学方法观察大鼠肝脏缺血再灌注损伤前后尿液中的代谢产物：糖代谢中的乳酸；蛋白质代谢中丙氨酸、丝氨酸；脂质代谢中的甘油3磷酸等指标的变化趋势同血清酶学、肝脏病理切片结果符合。3.用GC/MS的代谢组学方法,通过尿液,可以真实地反映出大鼠肝脏缺血再灌注损伤及恢复过程,对大鼠肝脏缺血再灌注损伤前后尿液中的代谢产物进行观察、对比,其变化趋势与血清酶学、肝脏病理变化所反映的损伤恢复的变化趋势基本相同。GC/MS的方法,不仅用尿液获取标本方便,且能够更为全面、动态地观察肝脏情况,可作为一种新的、敏感的动态评估肝脏的监测方法。