附子是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根加工品,具有回阳救逆,补火助阳,散寒止痛等功效,药用及人工栽培历史悠久,常被用于亡阳虚脱,肢冷脉微,虚寒吐泻及脘腹冷痛等症状,有毒。附子药用价值巨大,栽培历史虽久,但目前生产上仍然采用“山区育种,坝区栽培”的传统生产模式,栽培区每年引种的种源地都不固定,导致种源混乱及不稳定,迄今为止没有一个有效成分含量明显增高的栽培新品种。附子的主要生物活性成分乌头碱,在生物碱分类中属于二萜类生物碱,本研究通过对二萜类化合物生物合成中的关键酶基因牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(GGPS)进行克隆及组织表达分析,同时通过HPLC对不同生长期、不同植物组织中主要的药用活性乌头碱：双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱、乌头碱)进行含量检测,预测了GGPS基因的功能,探讨了乌头GGPS基因对于附子植物体内乌头碱类生物碱生物合成的作用,为揭示乌头碱类生物碱生物合成途径奠定了基础,为通过生物技术的方法培育具有高乌头碱含量的附子新品种提供了途径。本研究主要得到了以下结果：1、乌头GGPS基因的克隆：首次从附子种根组培材料中通过同源克隆的方式,结合RACE与转录组数据克隆得到了一个长为1420bp的cDNA序列,NCBI同源比对显示其与芍药丹参等物种GGPS基因同源性较高,与金盏花(Adonis aestivalis)同源性最高,达80%;ORF Finder显示其CDS区长为861bp,编码287个氨基酸；同源序列多重比对及分子系统进化分析表明其具有GGPS基因共有的2个多聚异戊二烯基合酶的特异序列“LMHDDLPCMDNDDLRRG" "IGLLFQVVDDILD",以及全部5个保守域；预测到GGPS蛋白分子质量为30.95kDa,等电点为5.24；亚细胞定位预测显示其主要在叶绿体中表达,线粒体及其他部位也有少量表达；多维结构分析显示其结构中无规则卷曲占30.56%,α-螺旋占65.28%,p-折叠占4.17%;结构比较显示其三维结构具有高度的保守性。2、GGPS基因在不同生长时期的表达：对所有材料的荧光定量PCR数据进行不同生长时期的纵向比较,结果显示,目的基因植株的不同生长时期都有不同程度的表达。具体到植物组织,不同植物组织在不同时期的表达量不同,表达峰值时期也有组织间差异,但总体来说就,其表达量与植株的生命代谢活动的强度呈现明显的正相关关系。3、GGPS基因在不同组织中的表达：GGPS基因在各组织中表达量差异较大。在生长旺盛期,组织间表达量比较为叶>茎>根>须根。4、有效成分在不同组织中的含量：在每个批次的不同组织样品中都检测出了乌头碱,说明了在附子植株中乌头碱的合成部位并不仅限于根部,而是植株各个组织都有合成,但含量却不一样,从本研究结果来看,植株不同组织间乌头碱含量高低依次为须根>子须根>根>子根>叶>茎。5、有效成分在不同生长时期的含量：在不同生长时期附子乌头碱含量检测实验结果中,不同组织在不同生长时期的含量不同,且线性关系也不一样,叶和根中含量随时间呈先升高后降低的趋势,茎中乌头碱含量一直升高,而须根中的乌头碱含量随时间变化不大。6、GGPS基因与乌头碱生物合成的关系：对于GGPS基因的表达及乌头碱含量分析发现,乌头碱的合成与目的基因的表达在植株部位上高度一致,且其表达强度随时间的趋势与乌头碱含量动态变化随时间的趋势一致,双变量相关性分析显示相关系数为0.993,表明在0.01水平上显著相关,说明了乌头碱的合成与GGPS基因的表达密切相关,从而可以推断得知乌头碱的生物合成与二萜代谢途径有关、其生物合成途径为从二萜到二萜生物碱的结论。