目的：胚胎干细胞是一类来源于囊胚内细胞团的全能细胞,可以在体外高度增殖和自我更新,并且可以定向诱导分化成体内的各种细胞类型。神经退行性疾病是由于患者体内缺失了相应的功能性细胞所致,随着时间的推移而恶化,以导致功能障碍。因此,胚胎干细胞用于神经退行性疾病的细胞替代治疗具有巨大的医学研究价值与应用前景。最近的研究提示,在使用五步法进行ES的神经定向分化的增殖期(在Stage4期)细胞的生长状态会呈现两种截然不同的类型。第一种,在培养神经前体细胞群体时在培养基内可以自由浮动的不固定的,称之为球细胞。第二个群体是培养的时候是贴壁成单层细胞的,是由均一的细胞组成的,称之为贴壁细胞。同时,球细胞在移植入正常免疫功能小鼠脑内后,没有形成肿瘤。但是贴壁细胞的作用还知之甚少。因此本研究目的集中在通过分离贴壁细胞和球细胞,并检测贴壁细胞在增殖、凋亡和分化过程中对球细胞的作用。检测贴壁细胞的致瘤能力以及对球细胞的致瘤性的影响。从而为更好地选择神经前体细胞应用于临床提供帮助。　　 材料和方法：第一,为了达到上述目的,需要一个稳定的mES诱导方法。首先在MEF滋养层上培养mES维持其未分化状态。应用五步法,诱导mES往Nestin阳性的神经前体细胞和Tuj—1阳性的神经元进行定向分化。对分化得到的细胞进行Nestin、GFAP、Tuj—1染色鉴定其在Srage4和Stage5期的分化效果。第二,mES分化在Stage4阶段形成具有聚集成球的球细胞和贴壁生长的贴壁细胞。用胶原酶消化培养的细胞,利用其沉降速率的不同分离出贴壁细胞和球细胞。计算贴壁细胞和球细胞的细胞比例。观察贴壁细胞的生长状态、增殖特性。免疫细胞化学染色。检测贴壁细胞的分化潜力。第三,通过把贴壁细胞和球细胞进行直接接触、间接接触共培养,以及单独培养细胞、MEF和球细胞直接接触共培养,分组比较,用流式细胞技术检测球细胞在Stage4的BrdU掺入率、AnnexinV凋亡率,和在Stage5阶段的Tuj-1形成比率。第四,检测贴壁细胞的致瘤能力和对球细胞致瘤性的影响。共分4组:贴壁细胞和球细胞混合移植、单独移植球细胞、单独移植贴壁细胞、移植mES细胞为对照组。注射到4—5周龄的18—22gBALB/c—nu裸鼠皮下,连续观察16周,检测其形成肿瘤的能力。　　 结果：使用五步法对mES进行分化可以有效地得到Nestin阳性的神经前体细胞和Tuj-1阳性神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。贴壁细胞呈单层贴壁生长,长梭形或不规则多角形,连续培养不会形成细胞聚集物。BrdU掺入率在20％左右,每周传代一次。Stage4期贴壁细胞为Nestin阳性、Oct-4阴性。Stage5期有极少的GFAP阳性星形胶质细胞,其余检测maker均为阴性。直接接触共培养组,球细胞的BrdU掺入率为69.8±8.2％,Transwell组中球细胞的BrdU掺入率为49.9±7.1％,单独球细胞组的BrdU掺入率为41.5±6.9％,MEF对照组为63.1±10.0％。Annexin V凋亡检测结果:直接接触、间接接触、单独球细胞、MEF对照组的细胞凋亡率分别为7.2±1.0％,9.7±0.6％,11.5±0.6％,6.3±1.3％。直接接触、间接接触、单独球细胞、MEF对照组的Tuj—1阳性细胞率分别为73.3±3.3％,64.7±5.4％,52.6±5.6％,56.0±6.1％。贴壁细胞没有形成肿瘤,贴壁细胞和球细胞混合组有33％形成肿瘤,单独球细胞组有30.4％形成肿瘤,mES对照组92.3％形成肿瘤。　　 结论：五步法诱导mES得到神经前体细胞和神经元。贴壁细胞表达Nestin。贴壁细胞在体外能促进球增殖并减少凋亡。贴壁细胞在体外对球细胞形成Tuj-1阳性细胞产出率有促进作用。贴壁细胞在体内未发现有致瘤性,贴壁细胞在体内不影响球细胞的致瘤性。