骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种慢性退行性关节疾病,主要病理特征是关节软骨退变、软骨下骨硬化、滑膜增生以及关节边缘骨赘形成。目前全球地区范围内已有超过3亿OA患者,而在我国原发性OA在40岁以上人群中的总体患病率高达46.3%。膝关节是其最常见的发病部位,临床表现为膝关节肿胀、疼痛和功能障碍,具有较高患病率和致残率,给社会和家庭带来极大的经济负担。目前国内外OA大多数采用药物、康复及外科手术等治疗手段,而保守治疗主要是疼痛的管理。由于其病理机制复杂多变,目前采用的这些治疗手段均未取得预期疗效。因此,通过合理有效的方法探究OA发生发展的机制,寻找理想的治疗靶点,并对其进行针对性干预对于OA的治疗具有极其重要而深远的意义。迄今仍然未能证实哪种因素直接导致了骨关节炎。在各种刺激因子（炎症、压力等）的作用下,软骨细胞发生脂质和DNA过氧化损伤,细胞发生肥大、衰老和凋亡,从而减弱软骨细胞合成细胞外基质的能力;同时伴随着炎症介质和细胞外基质降解酶（如基质金属蛋白酶MMPs和蛋白聚糖酶ADAMTS）的表达升高,能够进一步降解Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,导致软骨细胞外基质的破坏降解从而引起不可逆性损伤,最终关节软骨破坏。由此可见软骨细胞外基质的降解和破坏是导致骨关节炎形成的主要原因,针对其发病机制采取有效措施有望给骨关节炎的治疗带来曙光。近年来,从天然的植物中提取的小分子量单体化合物,如大蒜素、橙皮素、青蒿素等。由于具有抗炎、抗氧化及抗病毒等药理学活性,在对疾病的防治中发挥重要作用。小分子化合物通常分子量低于1000Da,因其较低的分子量,易于渗透磷脂双层细胞膜进入细胞内部,参与调控细胞或组织功能,并且具有较低的免疫原性。黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物。它广泛存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实等中,不仅数量种类繁多,而且结构类型复杂多样。黄酮类化合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞具有多种药理作用。已有研究证实,黄酮类化合物在炎症反应,氧化应激和软骨细胞外基质等方面发挥重要作用。高良姜素（又名3,5,7-三羟基黄酮）,分子量为270.24,来自于姜科植物高良姜的根茎中的一种黄酮类化合物。据报道,高良姜素可减弱氧化应激,炎症和细胞凋亡。此外,还可在胶原诱导的关节炎和骨髓源性巨噬细胞中调节破骨细胞的生成。高良姜素灌胃后可降低小鼠接触性皮炎的皮肤炎症,且其减轻炎症的效果显示出一定的浓度依赖。由此可见,高良姜素可在肾脏,皮肤和关节等疾病中发挥积极作用。RNA-Seq（RNA-sequencing）也称为转录组测序,是最新发展起来的利用新一代测序技术进行转录组分析的技术,可以全面快速地获得特定细胞或组织在某一状态下几乎所有转录本的序列信息和表达信息。在分析转录本的结构和表达水平的同时,还发现未知转录本和稀有转录本,从而准确地分析基因表达差异、基因结构变异、筛选分子靶点等生命科学的重要问题。基于以上我们设想,黄酮类小分子化合物高良姜素在OA进展中发挥作用。在本项研究中,我们准备探讨该药物在体内外对OA的作用,并基于转录组测序进行作用机制的研究,为探索OA治疗提供新方法。第一部分高良姜素延缓OA进展的体外研究目的:研究高良姜素对体外骨关节炎模型的影响方法:从患膝关节骨关节炎患者行膝关节置换丢弃的软骨中分离原代人OA软骨细胞。采用普通显微镜观察细胞形态、阿利新蓝染色及免疫荧光染色鉴定获取的细胞为软骨细胞。高良姜素（0、0.01、0.1、1、5、10、20、40、60、80和100μM）干预人OA软骨细胞24h。Cell Counting Kit-8（CCK-8）法观察高良姜素对人OA软骨细胞的活力影响,Western-Blot法检测不同浓度的高良姜素（0、0.01、0.1、1、10μM）干预24h后,软骨细胞MMP13、II型胶原蛋白α1链（COL2A1）表达变化。同时,通过逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测软骨细胞细胞外基质相关基因COL2A1、Aggrecan（ACAN）、ADAMTS5、MMP13的表达水平。随后再次通过免疫荧光染色检测高良姜素对COL2A1表达水平的影响。体外培养患膝关节骨关节炎患者行膝关节置换丢弃的人软骨块,不同浓度高良姜素干预2周后,COL2A1免疫组化染色和番红O染色检测软骨块中COL2A1和蛋白聚糖的含量变化。结果:1原代人OA软骨细胞呈梭形,阿利新蓝可以与软骨细胞内含有阴离子基团的硫酸根（如硫酸软骨素）形成复合物而呈现为蓝色,免疫荧光染色可见人软骨细胞胞浆中的COL2A1呈绿色。以上方法均显示我们从关节软骨分离的细胞为软骨细胞。2高良姜素在0-10μM浓度下对人OA软骨细胞没有明显的细胞毒性,但在20μM或更高浓度下却有明显的细胞毒性。3在人OA软骨细胞中,我们发现高良姜素处理（0.01-10μM）后细胞外基质相关基因COL2A1、ACAN表达水平上调,MMP13、ADAMTS5表达水平降低。4高良姜素干预后,软骨细胞COL2A1含量升高。5高良姜素干预后,人OA软骨块中蛋白聚糖和COL2A1的含量升高。结论:1高良姜素在一定浓度范围内对人OA软骨细胞的活力无毒性作用。2高良姜素可以抑制人OA软骨细胞外基质降解酶的产生,减少软骨细胞外基质的降解。3高良姜素可以提升人OA软骨块细胞外基质的含量。第二部分高良姜素延缓OA进展的体内研究目的:探索高良姜素关节腔注射对大鼠OA的治疗效果。方法:本实验采用右内侧半月板失稳（destabilization of medial meniscus,DMM）建立SD大鼠骨关节炎模型,对侧膝关节行假手术,不切断韧带。分别是正常组（Normal）、假手术组（Sham）、DMM生理盐水干预组（Vehicle）、DMM高良姜素干预组（20,40,60mg/kg）。大鼠膝关节腔注射体积为100μl,每周2次,连续注射4周。4周后,首先采用热板实验与双足平衡法测痛实验对大鼠的膝关节疼痛及炎症情况评估。随后将大鼠处死,取膝关节标本,采用苏木精伊红（hematoxylin eosin,HE）、番红固绿染色评估大鼠膝关节的软骨组织;采用免疫组织化学染色法检测膝关节软骨中COL2A1、MMP13、ADAMTS5和PRELP的表达量。采用国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）分级系统对OA软骨的病理变化进行评分。HE染色观察最大治疗剂量下大鼠肝、肾组织有无异常,初步评估其药物毒性。结果:1所有的SD大鼠造模术后恢复良好,无死亡、感染等不良情况。2热板实验以及双足平衡法测痛实验结果显示骨关节炎大鼠膝部疼痛被高良姜素有效缓解。3 OARSI评分结果显示高良姜素治疗后骨关节炎大鼠膝关节软骨的退变被缓解。4化学染色显示高良姜素有效缓解了大鼠膝关节退变和关节软骨细胞外基质降解。5免疫组织化学染色提示,在高良姜素干预后膝关节软骨细胞外基质降解减少。6 HE染色结果提示到高良姜素对大鼠肝、肾组织没有明显的病理学负面影响。结论:1高良姜素膝关节腔注射未表现出明显的毒性作用。2高良姜素膝关节腔注射可以有效缓解OA模型大鼠的疼痛症状。3高良姜素膝关节腔注射可以降低MMP13和ADAMTS5表达,增加二型胶原的含量。4高良姜素抑制ECM降解酶的表达,增加ECM含量,从而缓解OA进展。第三部分基于转录组学探究高良姜素延缓OA的作用机制目的:基于转录组学探究高良姜素延缓OA进展的作用机制方法:人OA软骨细胞在体外培养。待细胞密度到达80-90%之间时,用10μM的高良姜素干预细胞24小时,用TRIzol法进行细胞全RNA提取。通过转录组测序,生物信息学分析,探究高良姜素干预人OA软骨细胞的作用机制。WesternBlot、RT-q PCR和免疫荧光染色检测不同浓度的高良姜素（0、0.1、1、10μM）干预24h后软骨细胞中PRELP的表达变化。慢病毒转染实验敲低人OA软骨细胞PRELP,进行功能逆转实验。结果:1高良姜素干预后,差异性表达基因PRELP、COMP等水平明显被上调。2我们发现,随着高良姜素浓度的升高,PRELP表达也随之升高。3在高良姜素干预后,PRELP和COL2A1被上调,MMP13被下调。采取慢病毒转染细胞敲低PRELP后,PRELP的表达被明显抑制,MMP13的表达被激活,同时COL2A1的表达水平降低。当使用高良姜素重新干预后,PRELP的表达被重新上调,MMP13的表达也被抑制,同时COL2A1的表达水平被上调。结论:1 PRELP的表达水平在高良姜素处理后被明显上调;2 PRELP基因敲低后MMP13和ADAMTS5的表达被激活,COL2A1的表达水平降低。3高良姜素上调PRELP表达,抑制MMP13和ADAMTS5的表达,增加COL2A1的表达水平。4高良姜素可通过激活PRELP调控软骨细胞外基质的分解代谢,抑制ECM降解酶的水平,减少细胞外基质的降解,从而延缓OA的进展。