共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是亚油酸的异构体,主要存在于反刍动物的肉及乳制品中,是人类膳食中CLA的主要来源。共轭亚油酸具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、减少脂肪堆积、增强机体免疫力、促进生长等功能,随着共轭亚油酸研究的越来越深入,现已逐渐应用于人类的营养与保健中。本实验主要研究内容如下:(1)采用冷冻分离法联合尿素包合法提取黄油中共轭亚油酸。首先冷冻结晶法对混合脂肪酸进行冷冻结晶分离,研究不同有机溶剂、混合脂肪酸和溶剂比、冷冻时间、冷冻温度四个单因素对CLA纯度和得率的影响。经液相检测得出最佳提取条件:混合脂肪酸与无水乙醇的比例为1:12,处理时间9 h,处理温度为-20℃,得到CLA纯度为8.49%,得率为85.62%。在冷冻结晶的基础上进一步采用尿素包合的方法纯化CLA。研究回流时间、包合时间、包合温度、混合脂肪酸:尿素:无水乙醇四个单因素对CLA纯度和得率的影响,结果表明,回流时间、包合时间对CLA的纯度和得率影响均较小,包合温度、尿素/无水乙醇、混合脂肪酸/尿素影响较大,然后选择对实验结果影响显著的包合温度、尿素/无水乙醇、混合脂肪酸/尿素进行响应面优化,得到最佳包合条件:包合温度21.70℃,回流时间15 min,包合时间3 h,尿素/无水乙醇为0.31,混合脂肪酸/尿素为0.37,在该条件下进行尿素包合,得到的CLA纯度平均值为22.55%,得率平均值为81.57%。(2)通过多次灌胃二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthraene,DMBA)的方法成功建立小鼠乳腺癌模型,小鼠成瘤稳定,特异性好。模型组和紫杉醇组出现肿瘤,CLA组、LA组、空白组均未发现肿瘤。HE染色观察不同处理后小鼠各器官的变化以及肿瘤组织的切片观察,结果表明,DMBA处理会引起肝脏、肾脏、脾脏的损伤,肿瘤未见肺部以及远处转移,各组织病变趋势排序如下:肝脏:模型组>紫杉醇组>LA组>空白组、CLA组。肺:紫杉醇组>模型组>LA组>CLA组、空白组。肾脏:模型组>紫杉醇组、CLA组、LA组>空白组。脾脏:模型组>紫杉醇组、LA组>CLA组>空白组。其中,紫杉醇组对肺的损伤较大,本身紫杉醇具有一定的毒性,临床上常配合其他药物一起使用以减少紫杉醇副作用。肿瘤组织HE染色结果表明肿瘤处于癌前病变时期,肿瘤细胞生长旺盛时期;相对于模型组,紫杉醇组向周围组织浸润程度更低。利用免疫组织化学方法检测肿瘤组织Ki67、P53、PR、VEGF的表达,结果表明,Ki67在模型组有较高的表达,与紫杉醇组相比有显著性差异;P53在模型组和紫杉醇组表达量均很高;PR在模型组和紫杉醇组表达量均较低;VEGF在模型组和紫杉醇组表达也较低,但两组相比有极显著性差异。(3)共轭亚油酸抗癌机理的初步探究。取各组小鼠外周血进行生化指标检测,结果表明,各组小鼠白蛋白偏低,但无显著性差异,各组小鼠总蛋白含量基本在正常范围内。其中,模型组中丙氨酸氨基转移酶含量很高,与其余各组均有显著性差异(p<0.05),该指标过高也是肝脏受损的表现之一,其余指标均在正常范围之内。实时荧光定量PCR法检测小鼠血液中bcl-2、bax、p53 mRNA的表达水平。结果表明,bcl-2和bax的mRNA相对表达量各组均无显著性差异,模型组与CLA组相比,p53 mRNA相对表达量有显著性差异,其mRNA的相对表达量分别为8.75±0.44,4.67±0.33,且CLA组与其它各组相比均有显著性差异。这可能是因为CLA通过抑制p53的表达起到抑癌作用。