侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征,90%以上的肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤侵袭转移是一个复杂的、多因素调控的动态过程,它的发生涉及多个复杂信号通路,这些信号通路的激活及相互作用促使肿瘤从原发部位向周围组织浸润,经血管、淋巴管或体腔到达远端部位继续生长,形成与原发瘤性质相同的肿瘤。深入探索侵袭转移相关信号通路及分子机制,将有助于识别潜在的肿瘤治疗靶点,寻找制约临床治疗发展的突破口。CUL4B属于Cullin基因家族,该家族成员作为骨架蛋白是泛素E3连接酶(Cullin-RING E3 ubiquitin ligases,CRLs)的重要组成部分。CRLs 是目前已知的最人一类泛素连接酶,参与调控细胞周期、信号传导、DNA损伤修复及染色质重塑等重要生理过程。近年来研究发现CUL4B在食管癌、肺癌、直肠癌、宫颈癌和肝癌等多种肿瘤组织中高表达,克隆形成实验、裸鼠成瘤实验等进一步证实了 CUL4B 可能是一个新颖的癌基因。CUL4B与DDB1、ROC1及底物受体蛋白结合构成CRL4B复合物。我们和其他研究者已有数据提示CRL4B可通过单泛素化 H2AK119,协同转录抑制 PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT 以及 SIN3A/HDAC蛋白复合物。此外,CRL4B可负向调控多种抑癌基因和重要蛋白如P16、PTEN、IGFBP3、Wnt通路拮抗剂分子等,促进实体瘤发生发展。但是CUL4B在肿瘤中的研究目前尚处于起步阶段,人们对CUL4B在恶性肿瘤侵袭转移中如何发挥作用仍知之甚少。胃癌具有高发生率和死亡率,是最常见的威胁人类健康的消化道恶性疾病。GEO(Gene Expression Omnibus)和 TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据分析结果显示CUL4BmRNA水平在胃癌组织中显著高于正常胃粘膜组织。另一方面,我们课题组主要致力于前列腺癌侵袭和转移发生机制的研究及预后标志物的筛选等。在前期工作中,我们发现SOX4过表达是我国前列腺癌患者的独立不良预后因子,可作为独立指标判定病人预后;SOX4可协同TMPRSS2-ERG融合基因促进前列腺癌细胞的侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生。重要的是,我们发现CUL4B和SOX4基因在前列腺癌组织中表达密切相关。综上,我们推测CUL4B在胃癌和前列腺癌中均可能发挥致癌基因作用。因此,我们系统探讨CUL4B在胃癌和前列腺癌恶性进展中的作用和调控机制。本研究结合生物信息学分析,运用临床组织样本,体外细胞模型及体内荷瘤裸鼠模型明确CUL4B在胃癌和前列腺癌侵袭转移中的作用,并深入探讨其潜在的分子机制,为胃癌和前列腺癌治疗提供新思路。第一部分CUL4B通过调控miR-125a及其靶基因HER2促进胃癌的侵袭和转移研究报道,CUL4B在多种实体肿瘤中高表达,并通过表观遗传学抑制多种抑癌基因和重要蛋白促进肿瘤的发生发展。但是目前尚无CUL4B在胃癌中的作用及分子机制的研究。因此,本部分以胃癌细胞系和胃癌组织标本为研究对象,从临床标本,细胞水平及动物水平三个层面进行功能和分子机制的研究,取得了如下结果:1.CUL4B在胃癌组织高表达,并与不良预后有关:我们首先运用免疫组织化学技术检测CUL4B在154例胃癌组织中的表达,并运用生物信息学数据库(TCGA/GEO)分析CUL4B在胃癌组织及配对正常组织中的表达。结果显示,CUL4B在胃癌组织中表达明显上调,其表达与不良预后有关。随后系统分析了CUL4B过表达与临床病理学指标及常见基因异常的关联性。结果显示CUL4B过表达与HER2和EGFR表达显著正相关,并与远处转移、淋巴结转移及胃癌浸润深度呈显著相关。2.CUL4B促进胃癌细胞的增殖及肿瘤生长:为了探讨CUL4B在胃癌中的生物学作用,我们构建了 CUL4B干扰或过表达的胃癌细胞株MKN45和BGC823。EdU、MTS及平板克隆实验数据显示,干扰CUL4B表达可抑制胃癌细胞MKN45和BGC823增殖;相反,过表达CUL4B胃癌细胞增殖活性增强。皮下裸鼠成瘤进一步证实,稳定干扰CUL4B表达可延缓肿瘤生长。3.CUL4B在体内外可促进胃癌细胞侵袭和转移:划痕和Transwell小室实验结果显示,CUL4B可显著促进MKN45和BGC823细胞迁移和浸润。皮下和尾静脉移植瘤实验证实,CUL4B低表达可显著减弱MKN45细胞肌层浸润以及肺转移能力。众所周知,EMT发生可使细胞获得迁移浸润能力,进而促进肿瘤的发生发展。我们的数据显示,在MKN45细胞中干扰CUL4B表达后细胞变的更圆,具有上皮形态;相反,过表达CUL4B后细胞变梭形,细胞间的连接变的松散。免疫荧光、RT-qPCR及western-blot数据提示,CUL4B表达沉默可引起MKN45及BGC823细胞皮指标(E-cadherin,Claudin-1)表达升高而间质指标((Vimentin,N-cadherin)表达明显下降。4.CUL4B是miR-101的直接靶基因:根据miRNA靶基因预测软件(TargetScan、PicTar和miRanda)预测,我们选取了 4个可能调控CUL4B的miRNAs(miR-101、miR-204、miR-217及miR-133)进行后续验证。MKN45细胞转染上述4个miRNAs mimics及阴性对照NC后,western-blot结果显示,MKN45细胞转染miR-101mimics后CUL4B表达下降趋势最明显。双荧光素酶活性实验结果也表明,miR-101mimics 可显著减弱野生型CUL4B 3’UTR载体荧光素酶活性,而miR-101inhibitor 则上调其光素酶活性。然而,miR-101mimics 和 miR-101inhibitor对突变型载体荧光素酶活性并没有类似作用。5.在蛋白水平上,CUL4B和HER2表达正相关:为系统探 CUL4B在胃癌侵袭转移中的分子机制,我们在MKN45细胞中瞬时干扰CUL4B表达,并进行基因表达谱芯片分析,结果发现955个差异表达的基因(554个基因表达下调,401个基因表达上调)。进一步对表达谱数据进行Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析,发现在MKN45细胞中干扰CUL4B表达后,差异基因明显富集在HER2、EIF4E及VEGF-A信号通路。Western-blot及免疫荧光数据均提示,CUL4B表达与HER2表达正相关。裸鼠肿瘤组织和胃癌组织样本也进一步证实,CUL4B和HER2之间存在一定的关系。然而,我们在mRNA水平没有发现两者的关联性。因此,我们推测CUL4B可能在转录后水平调控HER2蛋白表达。6.CUL4B通过转录抑制miR-125a表达正向调控HER2表达:我们对miRNA-seq数据和靶基因是HER2的miRNAs(由TargetScan和miRanda预测)进行Venn图分析,得到了 3个miRNAs:miR-125a、miR-1254及miR-193a。结合文献报道及RT-qPCR验证,我们选取miR-125a进行后续研究。RT-qPCR数据表明,干扰CUL4B表达可上调Pri-miR-125a,Pre-miR-25a及miR-125a的表达,而过表达CUL4B显著减少其表达。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验证实CUL4B可通过直接结合到miR-125a启动子区(S2位置)来抑制miR-125a的表达。此外,我们在胃癌组织样本中发现miR-125a与CUL4B表达水平呈负相关。Western-blot数据显示胃癌细胞转染miR-125a mimics,可显著降低HER2的表达,转染miR-125a inhibitor则上调HER2表达。重要的是,荧光素酶实验证实,胃癌细胞共转染野生型HER2 3’UTR质粒和miR-125a mimics,荧光素酶活性明显减弱,而miR-125a inhibitor却增强荧光素酶活性。7.miR-125a参与CUL4B介导HER2的表达及胃癌细胞迁移:western-blot结果显示,CUL4B过表达可显著增强HER2的表达,而过表达CUL4B的同时过表达miR-125a可部分减弱HER2的表达。Rescue实验证实,过表达miR-125a可部分阻断CUL4B诱导胃癌细胞侵袭。8.HER2抑制剂可部分逆转CUL4B过表达诱导的EMT和转移:体外实验数据显示,在MKN45细胞中HER2抑制剂(赫赛汀/siHER2)可部分逆转CUL4B过表达引起的EMT表型变化。为了进一步证实细胞学实验数据,我们运用皮下移植瘤和尾静脉移植瘤模型进行体内研究。肿瘤体积长到200mm3时,用赫赛汀(20mg/Kg)或PBS作为对照处理肿瘤异种移植物。结果发现赫赛汀可部分阻断CUL4B过表达引起的胃癌细胞生长及肺转移。综上所述,在胃癌中,CUL4B通过转录抑制miR-125a表达正向调控HER2表达。HER2特异性抑制剂可有效干扰CUL4B-miR-125a-HER2-PI3K/AKT轴,进而阻断CUL4B诱导的胃癌细胞侵袭转移及EMT的发生。第二部分CUL4B通过调控miR-204及其靶基因SOX4促进前列腺癌的侵袭和转移前列腺癌是西方国家男性肿瘤相关性死亡的主要原因,约90%癌症相关死亡归因于肿瘤高复发或转移率。阐明前列腺癌恶性进展、复发及转移的分子机制显得尤为重要。本研究围绕"CUL4B-miR-204-SOX4轴"与前列腺癌恶性进展的关系这一科学问题展开,阐明CUL4B在前列腺癌恶性进展中的生物学作用及分子调控机制,为前列腺癌早期有效诊断、治疗策略选择及预后评估开辟新的途径。目前取得以下研究成果:1.CUL4B在前列腺癌组织表达上调,与前列腺癌恶性进展高度相关:免疫组织化学及公共数据库(TCGA/GEO)分析结果显示,CUL4BmRNA和蛋白水平在前列腺癌组织中表达均显著上调。进一步分析发现,CUL4B过表达与Gleason评分、临床分期及远处转移呈显著相关。Kaplan-Meier生存分析提示CUL4B过表达与生化复发高度相关。2.CUL4B促进前列腺癌细胞的增殖:EdU及MTS结果显示,与对照组相比,CUL4B低表达可抑制前列腺癌细胞增殖;反之,CUL4B过表达可增强细胞增殖活性。22RV1细胞也得到相似数据。此外,平板克降形成实验表明,在VCaP细胞中低表达CUL4B细胞克隆集落能力减弱;而过表达CUL4B可增强细胞克隆集落形成能力。体内动物实验进一步证实,干扰CUL4B表达可抑制肿瘤生长。3.CUL4B可诱导前列腺癌细胞EMT发生:Transwell数据显示,CUL4B低表达显著抑制VCaP和22RV1细胞迁移和浸润;相反,过表达CUL4B导致细胞迁移和浸润能力增强。随后,我们探讨CUL4B介导的细胞迁移浸润是否是EMT诱导的。RT-qPCR及western-blot数据显示,抑制CUL4B表达后E-cadherin表达水平升高,而N-cadherin和Vimentin表达水平降低。免疫荧光实验得到相似的结果。4.在前列腺癌中,SOX4是CUL4B下游靶基因:我们课题组前期研究发现SOX4通过介导EMT在前列腺癌进展中发挥重要作用,并且和不良预后有关。此外,CUL4B在食管癌和宫颈癌等多种实体瘤中表达上调,发挥致癌作用。这提示CUL4B和SOX4之间可能存在一定的关联。与预期一致的是,western-blot结果显示,在VCaP细胞和22RV1细胞中抑制CUL4B表达SOX4表达水平降低;相反,过表达CUL4B可引起SOX4表达水平升高。免疫荧光数据也提示CUL4B表达与SOX4表达正相关。前列腺癌患者组织样本中CUL4B和SOX4免疫组织化学检测结果显示,CUL4B和SOX4在Gleason评分=8-10的病例中的表达均显著高于Gleason评分=6-7的病例,提示CUL4B与SOX4表达呈正相关。5.CUL4B通过激活SOX4正向调控Wnt/β-catenin信号通路:Wnt/β-catenin信号通路与恶性肿瘤的发生发展密切相关。我们的数据发现,在VCaP及22RV1细胞中分别干扰CUL4B表达均可导致Wnt通路关键分子β-catenin和CyclinD1表达水平降低。在VCaP细胞中过表达CUL4B、β-catenin和CyclinD1表达水平升高。而同时过表达CUL4B并抑制SOX4表达可部分逆转CUL4B过表达引起的β-catenin和CyclinD1表达上调。6.CUL4B通过转录抑制miR-204表达正向调控SOX4表达:上述研究发现CUL4B在蛋白水平上正向调控SOX4,但是RT-qPCR数据显示,SOX4mRNA水平的变化不受CUL4B影响,提示CUL4B调控SOX4的表达可能发生在转录后水平。结合miRNA靶基因预测软件(TargetScan、miRDB、PicTar和RNA22)及RT-qPCR筛选,我们最终选取miR-204进行后续研究。ChIP结果证实CUL4B直接结合到miR-204启动子区。Western-blot数据显示,VCaP及22RV1细胞转染miR-204 mimics可显著降低SOX4的表达。而转染miR-204 inhibitor可上调SOX4表达。此外,荧光素酶实验发现VCaP及HERK293T细胞共转染野生型pmiR-GLO-SOX4 3’UTR质粒和miR-125amimics,荧光素酶活性明显降低;而共转染突变型pmiR-GLO-SOX4 3-UTR质粒和miR-125a mimics,荧光素酶活性未见明显变化。7.miR-204参与CUL4B诱导的前列腺癌细胞迁移浸润:western-blot、划痕及Transwell小室实验显示CUL4B过表达可促进前列腺癌细胞EMT的发生,并增强细胞迁移浸润能力。同时过表达CUL4B和miR-204可以逆转CUL4B过表达引起的上述表型变化。综上所述,CUL4B是驱动前列腺癌转移和进展的关键癌基因。CUL4B可通过转录抑制miR-204正向调控SOX4的表达,进而促进前列腺癌侵袭转移。miR-204可部分逆转"CUL4B-miR-204-SOX4轴"诱导的前列腺癌侵袭和转移。上述研究我们的研究结果丰富了对侵袭性前列腺癌分子机制的认识,为侵袭性前列腺癌的干预提供新靶点。