1目的前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性泌尿生殖系统最重要的癌症之一,虽然其发病率在中国明显低于欧美地区,但其发病率正在显著上升。在我国多数被确诊的前列腺癌患者已是肿瘤的中晚期,失去根治机会,只能采用内分泌治疗,但是经过中位时间14～30个月,几乎所有患者都将发展为激素非依赖性前列腺癌(AIPC)及激素难治性前列腺癌(HRPC),目前对于HRPC仍没有一个标准有效的治疗方案,西医的各种治疗效果欠佳,而应用中医药治疗HRPC取得了一定疗效。前列消癥汤是我国中西医结合泌尿外科奠基人之一刘猷枋教授创制的治疗晚期前列腺癌的方剂,该方由炙黄芪、生薏米、黄精、莪术、土贝母、猪苓、白花蛇舌草七味中药组成,具有益肾健脾、清热解毒、活血利湿的功效。本方扶正与祛邪并用,通过健脾益气,益。肾阴填精髓来扶正祛邪,重视清热利湿与活血行气以祛邪抗癌。前列消癥汤临床应用已十余年。通过总结既往治疗晚期前列腺癌90例,发现前列消癥汤能明显缓解患者排尿困难、食欲减低、乏力等症状,能延长雄激素依赖性向非依赖性的发展时间,明显提高了患者的生活质量。本研究通过对前列消癥汤治疗35例激素难治性前列腺癌患者的临床观察和前列消癥汤含药血清作用人前列腺癌PC3细胞的体外实验,从PI3K/Akt信号通路探索前列消癥汤治疗激素难治性前列腺癌可能的分子机制,阐述其科学性,为总结和挖掘刘猷枋名老中医经验提供新思路。2方法2.1临床观察部分共纳入临床病例72例,全部患者既往均采用药物去势治疗,年龄50～87岁；病程18～36个月,按患者意愿将其分为前列消癥汤联合内分泌治疗组(治疗组)及西医治疗组(对照组)两组。对照组采用药物去势治疗：即皮下注射醋酸戈舍瑞林缓释植入剂3.6mg或肌肉注射醋酸曲普瑞林3.75mg,每28-33天1次。治疗组采用与对照组相同的药物去势方案加用前列消癥汤。最终治疗组共剔除2例(加用化疗1例,放疗1例),对照组剔除4例(加用化疗1例,放疗1例,失访2例),最终有效病例66例,治疗组35例和对照组每组31例,治疗组和对照组平均年龄分别是77.2岁和74.19岁。在6个月的治疗过程中,分别在治疗前、治疗后第1月、3月、6月采集患者生活质量观察指标：FACT-P (Version4)量表评分、Karnofsky量表评分、中医症状量表评分及实验室指标：前列腺特异性抗原(PSA)、血清睾酮(T)、全血细胞分析白细胞数(WBC)、血红蛋白(HB)。数据采用SPSS19.0软件,计量资料分析用两样本均数比较的t检验,计数资料分析用卡方检验、秩和检验。2.2体外实验部分本实验选取人PC-3细胞作为研究对象,按人和大鼠体表面积折算的等效剂量比率人(70.0kg)：大鼠(200g)=1：0.018换算大鼠的等效剂量,分为低剂量组(大鼠与人等效剂量),中剂量组(十倍于低剂量组),高剂量组(二十倍于低剂量两组),及生理盐水组4组,将生理盐水及各组前列消癥汤汤剂浓缩后给大鼠灌胃,制备大鼠空白血清及低、中、高剂量组含药血清。分别运用胎牛血清,大鼠空白血清及低、中、高三个剂量的大鼠含药血清培养前列腺癌PC-3细胞24小时后。运用CCK8法测量细胞增值,细胞流式技术测量细胞周期,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western Blot印迹法检测PI3K/Akt通路上游分子PTEN的蛋白表达及PI3K、Akt、 mTOR、p-4E-BP1和p70S6K蛋白磷酸化及表达,RT-PCR法检测含药血清对PI3K/Akt通路下游分子mTOR. NF-κB基因及上游PTEN基因mRNA的表达。3结果3.1临床观察部分卡式评分(Karnofsky Performance Status Scale, KPS)和FACT-P (Version4)量表评分是目前公认的用于评价肿瘤患者临床疗效的指标,本研究采用卡式评分、FACT-P (Version4)量表评分和中医症状评分对前列腺癌患者的生活质量进行评价。前列消癥汤联合西医治疗方案组(治疗组)患者卡式评分、FACT-P (Version4)量表评分及中医单项症状评分在治疗前比较均无统计学差异,而在疗后1月、3月、6月与同时间段西医治疗方案组(对照组)比较,均优于西医治疗组,均有统计学差异,疗后6月为显著性差异。实验室指标方面,治疗组疗后1月、3月PSA保持平稳,而对照组呈现上升趋势,两组具有显著差异；治疗组疗后6月PSA值再次上升,但上升的趋势慢于同时段对照组,具有显著性差异；前列腺癌患者所采用的去势及抗雄治疗会抑制肾脏分泌促红细胞生成素,导致患者出现血红蛋白降低的现象,所以我们采用血红蛋白(HB)为观察指标之一,在治疗前两组患者血红蛋白数量无差异,治疗后1月、3月、6月,治疗组HB数保持平稳,在正常值下线小幅波动,明显高于同时间段对照组,而对照组HB数量下降,出现低于正常值的情况,具有显著性差异；治疗前,治疗后1月、3月、6月与治疗前比较,治疗组及对照组白细胞数量在统计学上无差异,均处于正常值范围；治疗组和对照组患者经6个月的治疗,血清睾酮均处于去势水平；对照组只有2例患者出现轻微的肝功能异常,未予治疗很快自行恢复。3.2体外实验部分细胞增殖试验(CCK-8法)发现,不同浓度的前列消癥汤大鼠含药血清对前列腺癌PC-3细胞作用24小时、48小时、72小时后,均显示出细胞增殖抑制作用,随着药物浓度的升高抑制作用增强,中、高剂量组与对照组比较有统计学差异；不同剂量前列消癥汤大鼠含药血清培养PC-3细胞24小时后,流式细胞仪测定各组PC3细胞周期,PC-3细胞呈现出明显的Go/G1期阻滞现象,随着药物浓度的升高,阻滞于Go/G1期的细胞比例逐渐上升,相应的S期细胞比例明显下降,中、高剂量组与对照组比较有差异；采用Transwell小室法检测胎牛血清组及各含药血清组培养PC-3细胞24小时后,PC-3细胞降解matrigel胶并穿过8um孔径的聚碳酸酯侵袭能力的改变,结果显示,前列消癥汤中、高剂量组侵袭细胞数量明显减少,抑制率大于30%,具有抗侵袭作用,可以使PC-3细胞侵袭力下降;Western blot法检测各组前列消癥汤大鼠含药血清培养PC-3细胞24小时后细胞中PI3K/Akt信号通路关键蛋白变化的结果为,前列消癥汤低、中、高剂量组细胞内p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1和p-p70S6K蛋白水平及p-p65(NF-κB)蛋白水平呈下降趋势,而p-PTEN蛋白水平呈现升高趋势。前列消癥汤中、高剂量组p-Akt、p-4E-BP1和p-p70S6K蛋白水平及NF-κB蛋白表达下降,而p-PTEN蛋白表达升高,与对照组比较具有统计学差异：RT-PCR法检测各组前列消癥汤大鼠含药血清培养PC-3细胞24小时后PC-3细胞中mTOR、PTEN、RelA (NF-κB)基因表达变化的结果显示,高剂量组mTOR基因及RelA (NF-κB)基因的表达被抑制,PTEN基因的表达得到增强,与对照组比较均有差异。4结论4.1临床观察部分4.1.1前列消癥汤联合西医治疗方案能改善激素难治性前列腺癌患者的生活质量,提高卡式评分、改善晚期前列腺癌患者的身体状况、情感状况,使患者能更好的回归家庭及社会,改善和维持患者生存的各项基本功能。4.1.2前列消癥汤联合西医治疗方案能改善前列腺癌患者出现的纳呆、乏力、失眠、便秘、排尿困难、尿血、水肿等症状。4.1.3前列消癥汤联合西医治疗方案能延缓PSA增长速度。4.1.4前列消癥汤联合西医治疗方案能提高患者外周血HB。4.2体外实验部分4.2.1前列消癥汤可以通过上调PTEN基因的表达及蛋白翻译,阻断Akt的过度活化,从而抑制PI3K/Akt信号通路,使Go/G1期细胞比例增加,细胞停滞于G1期,从而抑制细胞的增值；前列消癥汤可以抑制Akt、mTOR蛋白及其下游关键蛋白4E-BP1和p70S6K的活化,阻断Akt/mTOR通路,抑制PC-3细胞增殖。4.2.2前列消癥汤可以抑制核转录因子NF-kB基因及蛋白的表达,阻断PI3K/Akt/NF-kB信号轴,抑制PC-3细胞溶解细胞周围基质,降低其浸润和转移的能力；前列消癥汤可以抑制Akt/mTOR/p70s6k通路中mTOR蛋白,p70s6k蛋白的活化,抑制肌动蛋白的细丝重构,降低细胞迁移能力。通过以上实验可以推断,前列消癥汤治疗激素难治性前列腺癌效果肯定,其可能的分子机制是前列消癥汤通过抑制前列腺癌细胞PI3K/Akt通路各级关键蛋白的活化及表达,抑制前列腺癌细胞的增值,促进细胞凋亡,并降低其溶解细胞周围基质及运动的能力,抑制其转移。当然,本研究只是从PI3K/Akt通路的一个方面进行了初步的探索,其明确的机制尚需广泛深入的研究来揭示。