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哮喘是一免疫失衡性疾病,即T淋巴细胞控制着炎症反应,Th1/Th2反应性失衡,Th2型细胞免疫应答异常增高,Th1型细胞免疫应答减弱在哮喘的发病过程中起着关键作用,此平衡失调被认为是哮喘发病的重要机制。糖皮质激素的应用巨大的改变了哮喘患者的临床症状及生存质量,成为支气管哮喘治疗的经典用药。然而,长期应用尤其在大剂量应用时具有明显的毒副作用；对少数重症哮喘患者可能存在对糖皮质激素治疗不敏感或是抵抗。因此人们一直为更有效的治疗哮喘寻求新突破,在变应性疾病中半乳糖凝集素-9(Galectin-9)和T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tim-3)在转录水平和蛋白水平都有明显升高,并且其改变与Th1/Th2细胞因子含量有直接关系,它们与变应性炎症过程密切相关。因此本研究探讨性的把Galectin-9及特异性表达于Th1细胞表面的Tim-3分子作为免疫调节的靶分子,通过免疫调节使哮喘中Th1/Th2反应失衡恢复平衡,以期能为哮喘发病机制研究与临床治疗提供理论和实验基础。目的本实验通过建立小鼠哮喘模型,探讨Galectin-9及其受体Tim-3在哮喘小鼠肺组织中的表达及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)激动剂罗格列酮(ROS)对其表达的影响,并与Th1/Th2细胞因子进行相关性分析,探讨Galectin-9及Tim-3对Th1/Th2平衡的影响机制。材料和方法1动物分组和模型制作方法清洁级BALB/c小鼠45只,雌性,5-8周龄,体重18-22g,购自郑州大学实验动物中心。按随机数字表法分为哮喘组、对照组、ROS干预组,每组各15只。哮喘组小鼠给予1%OVA/Al(OH)3混悬液0.2ml于第1d、7d、14d腹腔注射联合皮下注射致敏,共三次；第21d开始用2%OVA雾化吸入激发,每次30min,每日1次,持续2周；干预组于第28d起在激发前30min给予PPAR-γ激动剂罗格列酮灌胃干预(10mg/kg),持续1周；对照组用等量生理盐水致敏和雾化吸入,余同哮喘组。卵蛋白、罗格列酮液每次现配现用。2标本处理血清收集：末次激发后24h内,无菌条件下眼球动脉取血,收集外周血0.8ml置于EP管中,4℃静置2h,3000rpm/min离心10min,取上清液分装,于-80℃保存备作ELISA分析。肺组织标本：采血后用戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射进行麻醉,迅速开胸,暴露肺脏,观察肺脏大体改变,取左侧肺组织,快速放于液氮中冻存,留作PT-PCR实验用。然后经右心室插管至肺动脉,用生理盐水冲洗后取右肺中叶,置于4%的多聚甲醛溶液中固定24h,依次酒精梯度脱水,常规石蜡包埋,做厚度约5μm切片,行HE染色后,光学显微镜下观察肺组织、各级支气管及血管周围炎症细胞的浸润情况。3 ELISA检测血清中IL-4及IFN-γ含量实验过程严格参照试剂说明书进行,加终止液混匀后立即由自动酶标仪测定吸光度OD450值,以OD值为纵坐标,标准品为横坐标,绘制标准曲线,据样品的OD值确定其浓度。4 RT-PCR将液氮冻存的左肺组织用Trizol一步提取法提取总RNA,并反转录成cDNA,设计引物扩增目的片段。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,用Band Scan 5.0凝胶分析软件分别测定Galectin-9、Tim-3和内参GAPDH的灰度值,并以Galectin-9、Tim-3与内参GAPDH的比值作为该小鼠的代表值。5统计学方法应用SPSS16.0统计软件包进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±S)表示。多个样本均数的比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验；各因素间相关性采用Pearson相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1病理学改变小鼠肺组织切片HE染色显示：对照组肺组织结构完整,气管形态规则,粘膜上皮完整,各级支气管、肺泡、血管周围未见有炎症细胞浸润,肺泡形态规则,各支气管平滑肌未见增生,支气管腔内仅有少量分泌物。哮喘组小鼠肺组织切片可见肺内支气管粘膜下及血管周围有较多EOS浸润,粘膜下充血水肿,粘液腺增生,气道上皮细胞的脱落和上皮组织多处断裂,支气管腔内和肺间质处可见大量分泌物和炎性细胞渗出,支气管壁及基底膜可见轻度增厚且形态不规则。ROS组小鼠肺组织仍可见少量炎症细胞浸润等病理改变,但较哮喘组减轻。2 ELISA结果哮喘组IL-4含量(564.48±76.17)较对照组(347.55±44.31)、ROS组(483.81±68.36)有不同程度的增高；而IFN-γ含量(371.56±131.49)与对照组(599.21±105.31)、ROS组(398.67±120.67)比较有显著减弱,组间差异均具有统计学意义(p<0.05)。3 RT-PCR结果Galectin-9及Tim-3mRNA在对照组肺组织中仅有少量表达(0.305±0.051,0.296±0.054),而在哮喘组肺组织中表达量显著增加(0.614±0.092,0.542±0.084),ROS组二者的表达量较哮喘组降低但仍高于对照组(0.401±0.059,0.466±0.091),各组间差异具有统计学(p<0.05)4相关性分析对肺组织内Galectin-9及Tim-3mRNA表达量与血清中Thl及Th2的细胞因子IFN-γ和IL-4含量进行Pearson相关性分析,结果示：二者的表达强度与IL-4蛋白含量成正相关(r=0.691 r=0.568 p<0.01),与IFN-γ蛋白含量成负相关(r=-0.507 r=-0.403 p<0.01)结论Galectin-9和Tim-3mRNA参与了哮喘的气道炎症过程,罗格列酮干预治疗后哮喘小鼠肺部炎症减轻与Galectin-9和Tim-3mRNA表达降低有关。