耐热短链脱氢酶基因的重组表达及其酶特性研究

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耐热短链脱氢酶在手性醇合成中有很大的应用潜力。本文以一个来自极端嗜热菌Carboxydothermus hydrogenoformans SP.的短链脱氢酶SDR3为研究对象,在将其基因异源表达的基础上,考察了与不对称还原转化相关的一些酶学性质,测定了其催化底物谱,并选取其中一个底物进行了生物催化工艺开发的前期研究。短链脱氢酶基因sdr3的开放阅读框长为747bp,编码248个氨基酸残基,具有典型短链脱氢酶的保守位点。利用表达载体pET28a构建了该基因的重组表达质粒并进行了表达和优化。最佳诱导表达条件为:培养温度25℃,诱导剂IPTG浓度0.05mmol/L,诱导时间14h。将重组酶SDR3纯化后,研究了其酶学性质。结果显示对α酮酯有较高的活性,反应最佳温度为70℃,最佳pH为6.0。该酶具有较高的热稳定性,70。C处理15mmin后仍较为稳定,残余相对酶活达90%以上。在1mM终浓度下,重金属离子Zn2+和Co2+对酶活有显著的抑制作用。以重组酶SDR3为催化剂,以苯甲酸甲酰乙酯为底物,进行手性醇不对称合成的研究。利用葡萄糖脱氢酶GDH为辅助酶构建辅酶NADH循环再生系统,能大大降低反应过程中NADH的消耗。最终构建的反应体系在6h内能催化苯甲酸甲酰乙酯不对称还原合成R-扁桃酸乙酯,产率为55.27%,e.e.值为99.3%。
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